N-acetyl-p-d-glukosaminidas

N-acetyl-β-d-glukosaminidas (EC 3.2.1.30; EC 3.2.1.52) är ett mesofilt hydrolas som specifikt hydrolyserar N -acetyl-glukosider. Enzymet finns i en mängd olika marina och landlevande varelser med den primära funktionen att bryta ner oligosackarider i närvaro av vatten. En av enzymets primära funktioner är att målinrikta och hydrolysera oligosackarider som innehåller kitin . I denna kitinasfunktion bidrar enzymet till många organismers förmåga att bryta ner kitininnehållande molekyler och därefter smälta eller återuppta kitin, kol eller kväve i miljön. Enzymets kristallstruktur varierar något mellan organismer, men kännetecknas av tre eller fyra domäner med en aktiv plats. Tvärs över proteiner innebär det aktiva stället ett a-p-rör med antingen en arginin- eller tryptofanrester i cylinderfickan för att binda inkommande substrat.

Enzyme Commission (EG) nomenklatur

N-acetyl-β-d-glukosaminidas hänvisas ofta till under ett av två EG-nummer, beroende på vilken synonym som används i litteraturen. EC 3.2.1.30 hänvisar till det enda n-acetyl-β-d-glukosaminidasenzymet, som är ett av fyra i ett större enzymkomplex. EC 3.2.1.52 hänvisar till β-n-acetyl-hexosaminidas, ett komplex av 4 enzymer inklusive n-acetyl-β-d-glukosaminidas.

EG-nummer betydelse

De olika siffrorna i EC-sekvensen beskriver enzymfunktionen i stigande specificitetsordning:

  • EC 3. hänvisar till ett hydrolas: ett enzym som katalyserar hydrolys, eller en nedbrytningsreaktion med vatten som en av reaktanterna.
  • EC 3.2 hänvisar till ett glykosylas: ett enzym som specifikt hydrolyserar glykosylföreningar.
  • EC 3.2.1 hänvisar till ett glykosidas: ett enzym som hydrolyserar syre- och svavelglykosolföreningar.
  • EC 3.2.1.30 hänvisar till n-acetyl-β-d-glukosaminidas: ett enzym som hydrolyserar N- acetyl-glukosider.
  • EC 3.2.1.52 hänvisar till β-n-acetyl-hexosaminidas, en 4-enzymfamilj som har förmågan att hydrolysera terminala icke-reducerande n-acetyl-hexosaminrester (n - acetyl-glukosider och n-acetyl-galaktosider).

Synonymer

Utöver dess EG-nummer kan n-acetyl-β-d-glukosaminidas refereras till med flera synonymer i litteraturen. Dessa inkluderar:

  • p-n-acetylglukosaminidas
  • β-acetylaminodeoxiglukosidas
  • β-acetamidodeoxiglukosidas
  • β-acetylglukosaminidas
  • n-acetyl-p-glukosaminidas
  • n-acetyl-p-d-glukosaminidas
  • chitobias
  • acetyl-p-glukosaminidas
  • p-d-glukosaminidas
  • p-n-acetyl-d-glukosaminidas
  • p-n-acetylaminodeoxiglukosidas
  • exo-n-acetyl-p-d-glukosaminidas
  • p-nitrofenyl-p-n-acetylglukosaminidas
  • exochitinas
  • p-dn-acetylglukosaminidas

Reaktionsvägar

Den allmänna reaktionsstrukturen uppstår där, i närvaro av vatten, n-acetyl-β-d-glukosaminidas bryter oligosackarider till mindre sockerenheter. Mer specifikt hydrolyserar n-acetyl-p-d-glukosaminidas terminala icke-reducerande n-acetyl-p-glukosaminrester i kitinmolekyler (dvs. kitobios, kitotrios) och i glykoproteiner. Bindningar som bryts under hydrolys inkluderar β-glykosidbindningarna av β-glukosaminid och β-galaktosiminid, och specifika monosackaridprodukter inkluderar N-acetyl-d-glukosamin och N-acetyl-d-galaktosamin. N-acetyl-β-d-glukosaminidas har också observerats katalysera transglykosylering, vilket i sin tur underlättar skapandet av nya oligosackarider med olika aminorester. Vidare tros n-acetyl-p-d-glukosaminidas förlita sig på det givna substratet för att tillhandahålla den nukleofil som behövs för att starta hydrolys.

Vanliga substrat

Vanliga substrat som används i reaktioner med n-acetyl-β-d-glukosaminidas inkluderar:

  • p-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxi-β-d-glukopyranosid och H 2 O
  • p-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxi-β-d-galaktopyranosid och H 2 O
  • , n'-diacetylkitobios och H2O
  • 4-metylumbelliferyl-β-d-glukosaminid (eller galaktoaminid) och H 2 O

Vanliga produkter

Vanliga produkter som bildas i reaktioner med n-acetyl-β-d-glukosaminidas inkluderar:

  • n-acetylglukosamin och p-nitrofenol
  • n-acetylgalaktosamin och p-nitrofenol
  • n-acetylglukosamin
  • 4-metylumbelliferon och n-acetylglukosamin

K m

Km för n-acetyl-β-d-glukosaminidas har rapporterats vid värden som sträcker sig från 0,096 mM i marina svampar till 0,27 mM i Aeromonas sp. för hydrolys av p-nitrofenyl-p-dn-acetylglukosaminid. Samma reaktion katalyserad av proteiner isolerade från kalvhjärna genererades vid en observerad Km 0,72 mM, med en maximal reaktionshastighet på 2,5 μmol/mg per timme.

Inhibitorer

Produktmättnad

Ett sätt genom vilket n-acetyl-p-d-glukosaminidasreaktioner inhiberas är genom ökad mättnad av reaktionsprodukten. Hydrolys av oligosackarider (dvs. kitobios och kitotrios) till mono- och disackarider minskar i hastighet när substratpolymerisationsnivån ökar (dvs för kitooligosackarider med polymerisationsgrader mellan 5 och 8). På liknande sätt kan ökade koncentrationer av monosackarider (N-acetyl-D-glukosamin, glukos, galaktos) i reaktionslösningen minska aktiviteten med 12-70 %.

Joniska hämmare

Flera joner har identifierats som hämmande n-acetyl-β-d-glukosaminidasaktivitet. Dessa inkluderar:

  • Ag +
  • Cu 2+
  • Hg 2+
  • Zn 2+
  • Fe 3+
  • Ca 2+
  • Cd 2+

Andra inhibitorer

Andra molekylära föreningar har observerats sänka aktiviteten av n-acetyl-p-d-glukosaminidas. Dessa inkluderar:

  • CaCl2 _
  • MgSO4 _
  • 2-deoxi-2-acetamido-d-glukono-1
  • 5-lakton
  • jodacetamid
  • p-klorkvicksilverbensoat
  • p-aminofenyl-l-tio-p-L-fukopyranosid
  • n-acetylmuraminsyra
  • acetat

Organismer som producerar och använder n-acetyl-β-d-glukosaminidas

N-acetyl-β-d-glukosaminidas har registrerats och observerats i olika terrestra och marina organismer, allt från bakterier till megafauna. Dess aktivitet har dokumenterats omfattande i däggdjur, svampar, kräftdjur, broskfiskar, blötdjur, maneter och bakterier. Enzymets bredare funktion i organismen är nedbrytning och återupptag av kitinmolekyler erhållna från antingen extern konsumtion i miljön eller intern tillväxt i organismen. Enzymet har också observerats spela en nyckelroll i att bidra till lokala kvävenivåer som utsöndras av mikrobiella samhällen. Dessutom definieras detta enzym som en markör för upptäckt av akut njurskada - det finns i lysosomer av proximala tubulära celler och filtreras inte av glomerulus, utan rensas snabbt från blodomloppet av levern. Specifika exempel på hur n-acetyl-β-d-glukosaminidas fungerar i olika organismer ges i avsnitten nedan.

Matsmältning

Hos marina arter som konsumerar kräftdjur och/eller växtmaterial som innehåller kitin, såsom huvhajar ( Sphyrna tiburo ) eller antarktisk krill ( Euphausia superba ), hjälper n-acetyl-β-d-glukosaminidas nedbrytning av kitinmolekyler för matsmältningen. För antarktisk krill genereras enzymet i cytosolen i organismens celler och släpps sedan ut i tarmen under matsmältningen. Hos bonnethead-hajar, å andra sidan, produceras enzymerna faktiskt inte av hajen själv utan istället av kolonier av bakterier i de främre delarna av djurets tarm. Närvaron av dessa enzymer och deras funktion som kitinaser gör att huvhuvuden kan konsumera både kräftdjur och visst växtmaterial, vilket gör dem till en av de få om inte bara allätande hajarter. Vissa arter av marina bakterier, såsom Vibrio furnissii , använder n-acetyl-β-d-glukosaminidas för att hydrolysera p-nitrofenol (PNP)-β-GlcNAc och 4-metylumbelliferon,7-hydroxi-4-metylkumarin (MUF)-β -GlcNAc för ytterligare matsmältning. Här spelar enzymet ett kritiskt steg som gör att bakterierna får tillgång till kväve och kol från den lokala marina miljön.

Skalunderhåll och smältning

För marina organismer som har kitinösa skal, såsom krill eller räkor, spelar n-acetyl-β-d-glukosaminidas en framträdande roll för att underlätta smältning. I den antarktiska krillen, nordlig krill ( Meganyctiphanes norvegica ) och vanlig räka ( Palaemon serratus ) bryter enzymet terminala N-acetyl-glukosaminmonomerer från kitinmolekyler som frigörs under den initiala skalnedbrytningen i början av smältningsperioden. Under smältningsperioderna transporteras dessa monomerer kontinuerligt av vesiklar närmare epidermis, under den nybildade skalkutikulan, för återabsorption via porkanaler och återanvändning i det nya skalet efter molt.

Kväveremineralisering i jordar

När det frisätts av svampar och jordmikrober spelar n-acetyl-β-d-glukosaminidas en avgörande roll och ökar markens kväveremineraliseringshastighet genom att bryta ner kitin till aminosocker för remineralisering. Aktiviteten av n-acetyl-β-d-glukosaminidas (mätt i mg p-nitrofenol per kilogram jord per timme) har visat sig signifikant korrelera med ökad total kvävemineralisering, organisk kolproduktion och ammoniumfixering i lokala miljöer. På grund av de höga nivåerna av kitin i jordföreningar globalt, tyder denna förmåga hos n-acetyl-β-d-glukosaminidas på att enzymet är en nyckelspelare i omvandlingen av koncentrationer av kväve, kol och ammonium i mark och markberoende ekosystem av växter, djur och mikroorganismer.

Proteinstruktur

Termisk och pH-stabilitet

N-acetyl-β-d-glukosaminidas är en mesofil, med observerad strukturell och funktionell stabilitet mellan 40 och 55 grader Celsius. Maximal aktivitet registrerades vid 45 grader Celsius. Enzymet uppvisade stabil struktur och funktion mellan 3,8 och 6,0 pH, med maximal aktivitet vid 4,5 pH och en isoelektrisk punkt (en punkt utan laddning på proteinytan) vid 4,83 pH.

Molekylvikt

Mätningar av molekylvikten för n-acetyl-β-d-glukosaminidas sträcker sig från 68 000 g/mol (observerat i proteiner isolerade från marin svamp, Penicillium canescens ) till ~100 000 g/mol (observerat i proteiner isolerade från Aeromonas sp. ).

Kristallstruktur

Även om de strukturella egenskaperna hos n-acetyl-β-d-glukosaminidas inte är väl beskrivna för specifika proteiner isolerade över mångfalden av organismer som det har identifierats fungera inom, är kristallstrukturen och de aktiva platserna väl kartlagda i enzymer erhållna från flera arter av bakterier.

Streptococcus gordonii

N-acetyl-p-d-glukosaminidas isolerat från Streptococcus gordonii identifierades som innehållande 626 aminosyror med en tredomän-dimerstruktur. Varje monomer i dimeren innehåller sju cysteinrester och inga disulfidbindningar. Mycket av dimerytan innehåller hydrofoba rester. Två kristallformer har observerats, en definierad av symmetriska monomerer och den andra av asymmetriska monomerer. Den första domänen (N-terminal) innehåller aminoresterna 2-82. Denna domän definieras av en a-p-veck som innehåller fem strängar av parallella β-veckade ark som omsluter två a-helixar. Den andra domänen innehåller aminoresterna 83-400. Denna domän innehåller det aktiva stället inuti en triosfosfatisomeras (TIM) cylinder vid den C-terminala änden av domänen. Pipans mynning är ringad av åtta α-helixar, och de sex slingorna av cylinderstrukturen samverkar med den andra monomeren. Fatkonformationen skiljer sig något mellan de symmetriska och asymmetriska monomerkristallformerna. Slutligen innehåller den tredje domänen aminoresterna 401-627. Denna domän domineras av α-helixar, med fem helixar intill den aktiva platscylindern och i antiparallell konfiguration till varandra.

De dubbla kristallformerna av n-acetyl-β-d-glukosaminidas i Streptococcus gordonii tros underlätta enzymernas funktion genom konfigurationen av aktiva kontra vilande former. Den första kristallformen kännetecknas av närvaron av katalytiska syror på ändarna av cylinderns β-veck, där dessa syror sträcker sig direkt mot den inre cylinderns tryptofanrester. Denna konformation anses vara mer gynnsam för att styra inkommande oligosackarider till det aktiva stället för hydrolys. Däremot har den andra kristallformen flera β-veck som vänder sig bort från cylindern och öppnar det aktiva stället för lösningsmedel, vilket potentiellt hindrar effektiv hydrolys från att äga rum.

Serratia marcescens

Kristallstrukturen av n-acetyl-β-d-glukosaminidas isolerat från Serratia marcescens- bakterier observerades innehållande ett enda aktivt ställe inom enzymets tredje domän av fyra, kännetecknad av en α-β-fatveckning.

Escheria coli

N-acetyl-β-d-glukosaminidas som klonades och sekvenserades från Escheria coli kopplades till en gen sammansatt av 2655 nukleotider som kodade för 855 aminosyror för att ge det slutliga proteinet. För detta enzym identifierades fyra domäner, där återigen den tredje domänen innehöll det aktiva stället inom en åtta-strängad a-p-fatveck. Den första och fjärde domänen innehåller två β-veckade ark, medan den andra domänen är sammansatt av både a-helixar och β-veckade ark. I likhet med kristallstrukturen som beskrivs för Streptococcus gordonii , indikerar strukturerna som finns i enzymerna för Escheria coli att substratet passar in i cylinderfickan och är bundet till dess icke-reducerande terminala socker. Till skillnad från det aktiva stället för Streptococcus gordonii är emellertid bindningsresten i det aktiva stället för Escheria coli arginin snarare än tryptofan. Återigen förstås att substratet tillhandahåller den nukleofil som behövs för att starta enzymaffinitet till det aktiva stället.