Molekylär cytogenetik

Bild: exempel på karyotypning som visar totalt 46 kromosomer i genomet.

Molekylär cytogenetik kombinerar två discipliner, molekylärbiologi och cytogenetik , och involverar analys av kromosomstrukturen för att hjälpa till att skilja normala och cancerframkallande celler. Human cytogenetik började 1956 när det upptäcktes att normala mänskliga celler innehåller 46 kromosomer. Men de första mikroskopiska observationerna av kromosomer rapporterades av Arnold, Flemming och Hansemann i slutet av 1800-talet. Deras arbete ignorerades i årtionden tills det faktiska kromosomtalet hos människor upptäcktes som 46. 1879 undersökte Arnold sarkom- och karcinomceller med mycket stora kärnor. Idag kan studiet av molekylär cytogenetik vara användbart för att diagnostisera och behandla olika maligniteter såsom hematologiska maligniteter, hjärntumörer och andra föregångare till cancer. Fältet är överlag fokuserat på att studera utvecklingen av kromosomer, mer specifikt antalet, strukturen, funktionen och ursprunget för kromosomavvikelser. Den inkluderar en serie tekniker som kallas fluorescens in situ hybridisering , eller FISH, där DNA -sonder märks med olika färgade fluorescerande taggar för att visualisera en eller flera specifika regioner av genomet. FISH introducerades på 1980-talet och använder prober med komplementära bassekvenser för att lokalisera närvaron eller frånvaron av de specifika DNA-regionerna. FISH kan antingen utföras som ett direkt tillvägagångssätt till metafaskromosomer eller interfaskärnor. Alternativt kan ett indirekt tillvägagångssätt användas där hela arvsmassan kan bedömas för förändringar i antal kopior med hjälp av virtuell karyotypning. Virtuella karyotyper genereras från arrayer gjorda av tusentals till miljontals sonder, och beräkningsverktyg används för att återskapa genomet i silico .

Vanliga tekniker

Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

FISH-bilder av kromosomer från delande orangutangceller (vänster) och mänskliga (höger) celler. Gul sond visar 4 kopior av en region i orangutangomet och endast 2 kopior i människa.

Fluorescence In Situ Hybridization kartlägger enstaka kopior eller repetitiva DNA-sekvenser genom lokaliseringsmärkning av specifika nukleinsyror. Tekniken använder olika DNA-sonder märkta med fluorescerande taggar som binder till en eller flera specifika regioner av genomet. Den märker alla individuella kromosomer i varje stadium av celldelningen för att visa strukturella och numeriska avvikelser som kan uppstå under hela cykeln. Detta görs med en sond som kan vara lokusspecifik, centromerisk, telomer och helkromosomal. Denna teknik utförs vanligtvis på interfasceller och paraffinblockvävnader. FISH kartlägger enstaka kopior eller repetitiva DNA-sekvenser genom lokaliseringsmärkning av specifika nukleinsyror. Tekniken använder olika DNA-sonder märkta med fluorescerande taggar som binder till en eller flera specifika regioner av genomet. Signaler från de fluorescerande taggarna kan ses med mikroskopi , och mutationer kan ses genom att jämföra dessa signaler med friska celler. För att detta ska fungera måste DNA denatureras med hjälp av värme eller kemikalier för att bryta vätebindningarna; detta tillåter hybridisering att inträffa när två prover blandas. De fluorescerande sonderna skapar nya vätebindningar och reparerar på så sätt DNA med sina komplementära baser, som kan detekteras genom mikroskopi. FISH låter en visualisera olika delar av kromosomen i olika stadier av cellcykeln. FISH kan antingen utföras som ett direkt tillvägagångssätt till metafaskromosomer eller interfaskärnor. Alternativt kan ett indirekt tillvägagångssätt användas där hela arvsmassan kan bedömas för förändringar i antal kopior med hjälp av virtuell karyotypning. Virtuella karyotyper genereras från mikromatriser gjorda av tusentals till miljontals sonder, och beräkningsverktyg används för att återskapa genomet i silico .

Jämförande genomisk hybridisering (CGH)

Jämförande genomisk hybridisering (CGH), härledd från FISH, används för att jämföra variationer i antal kopior mellan ett biologiskt prov och en referens. CGH utvecklades ursprungligen för att observera kromosomavvikelser i tumörceller. Denna metod använder två genom, ett prov och en kontroll, som är märkta fluorescerande för att särskilja dem. I CGH isoleras DNA från ett tumörprov och biotin fästs. Ett annat märkningsprotein, digoxigenin, är fäst till referens-DNA-provet. De märkta DNA-proverna samhybridiseras till sönder under celldelning, vilket är den mest informativa tiden för att observera variationer i antal kopior. CGH använder skapar en karta som visar den relativa förekomsten av DNA och kromosomnummer. Genom att jämföra fluorescensen i ett prov jämfört med en referens kan CGH peka på vinster eller förluster av kromosomregioner. CGH skiljer sig från FISH eftersom det inte kräver ett specifikt mål eller förkunskaper om den genetiska region som analyseras. CGH kan också skanna ett helt genom relativt snabbt för olika kromosomobalanser, och detta är användbart för patienter med underliggande genetiska problem och när en officiell diagnos inte är känd. Detta inträffar ofta med hematologiska cancerformer.

Array jämförande genomisk hybridisering (aCGH)

Array jämförande genomisk hybridisering (aCGH) gör att CGH kan utföras utan cellodling och isolering. Istället utförs det på objektglas som innehåller små DNA-fragment. Att ta bort cellodlingen och isoleringssteget förenklar och påskyndar processen dramatiskt. Genom att använda liknande principer som CGH isoleras provets DNA och fluorescensmärkt, sedan samhybridiseras till enkelsträngade prober för att generera signaler. Tusentals av dessa signaler kan detekteras på en gång, och denna process kallas parallell screening. Fluorescensförhållanden mellan prov- och referenssignalerna mäts, vilket representerar den genomsnittliga skillnaden mellan mängden av var och en. Detta kommer att visa om det finns mer eller mindre prov-DNA än vad som förväntas genom referens.

Ansökningar

En cell som innehåller en omarrangering av bcr/abl-kromosomregionerna (övre vänstra röda och gröna kromosomen). Denna omarrangemang är associerad med kronisk myelogen leukemi och upptäcktes med FISH.

FISH-kromosomhybridisering på plats möjliggör studien av cytogenetik i pre- och postnatala prover och används också i stor utsträckning vid cytogenetisk testning för cancer. Medan cytogenetik är studiet av kromosomer och deras struktur, involverar cytogenetisk testning analys av celler i blodet, vävnaden, benmärgen eller vätskan för att identifiera förändringar i kromosomerna hos en individ. Detta gjordes ofta genom karyotypning och görs nu med FISH. Denna metod används ofta för att upptäcka kromosomala deletioner eller translokationer som ofta är förknippade med cancer. FISH används också för melanocytiska lesioner, och särskiljer atypiskt melanocytiskt eller malignt melanom.

Cancerceller ackumulerar ofta komplexa kromosomala strukturella förändringar såsom förlust, duplicering, inversion eller rörelse av ett segment. Vid användning av FISH kommer eventuella förändringar av en kromosom att bli synliga genom avvikelser mellan fluorescensmärkta cancerkromosomer och friska kromosomer. Resultaten av dessa cytogenetiska experiment kan belysa de genetiska orsakerna till cancern och kan lokalisera potentiella terapeutiska mål.

Molekylär cytogenetik kan också användas som ett diagnostiskt verktyg för medfödda syndrom där de bakomliggande genetiska orsakerna till sjukdomen är okända. Analys av en patients kromosomstruktur kan avslöja orsaksförändringar. Nya molekylärbiologiska metoder som utvecklats under de senaste två decennierna som nästa generations sekvensering och RNA-seq har till stor del ersatt molekylär cytogenetik inom diagnostik, men nyligen har användningen av derivat av FISH som multicolour FISH och multicolour banding (mBAND) ökat inom medicinsk applikationer.

Cancerprojekt

Ett av de aktuella projekten som involverar Molecular Cytogenetics involverar genomisk forskning om sällsynta cancerformer, kallat Cancer Genome Characterization Initiative (CGCI). CGCI är en grupp som är intresserad av att beskriva de genetiska abnormiteterna hos vissa sällsynta cancerformer, genom att använda avancerad sekvensering av genom, exomer och transkriptom, vilket i slutändan kan spela en roll i cancerpatogenes. För närvarande har CGCI klarlagt några tidigare obestämda genetiska förändringar i medulloblastom och B-cell non-Hodgkin lymfom. Nästa steg för CGCI är att identifiera genomiska förändringar i HIV+-tumörer och i Burkitts lymfom .

Vissa sekvenseringstekniker med hög genomströmning som används av CGCI inkluderar: helgenomsekvensering , transkriptomsekvensering , ChIP-sekvensering och Illumina Infinum MethylationEPIC BeadCHIP.

externa länkar