Metabolisk ingenjörskonst
Metabolic engineering är praktiken att optimera genetiska och regulatoriska processer inom celler för att öka cellens produktion av ett visst ämne. Dessa processer är kemiska nätverk som använder en serie biokemiska reaktioner och enzymer som tillåter celler att omvandla råmaterial till molekyler som är nödvändiga för cellens överlevnad. Metabolisk teknik syftar specifikt till att matematiskt modellera dessa nätverk, beräkna ett utbyte av användbara produkter och peka ut delar av nätverket som begränsar produktionen av dessa produkter. Gentekniker kan sedan användas för att modifiera nätverket för att lindra dessa begränsningar. Återigen kan detta modifierade nätverk modelleras för att beräkna den nya produktutbytet.
Det yttersta målet med metabol ingenjörskonst är att kunna använda dessa organismer för att producera värdefulla ämnen i industriell skala på ett kostnadseffektivt sätt. Aktuella exempel inkluderar att producera öl , vin , ost , läkemedel och andra bioteknologiska produkter. Några av de vanliga strategierna som används för metabolism är (1) att överuttrycka genen som kodar för det hastighetsbegränsande enzymet i den biosyntetiska vägen, (2) blockera de konkurrerande metaboliska vägarna, (3) heterologt genuttryck och (4) enzymteknik.
Eftersom celler använder dessa metaboliska nätverk för sin överlevnad kan förändringar få drastiska effekter på cellernas livskraft. Därför uppstår kompromisser inom metabolisk ingenjörskonst mellan cellens förmåga att producera det önskade ämnet och dess naturliga överlevnadsbehov. Därför, istället för att direkt ta bort och/eller överuttrycka generna som kodar för metaboliska enzymer, är det nuvarande fokuset att rikta in sig på de reglerande nätverken i en cell för att effektivt konstruera metabolismen.
Historik och applikationer
Tidigare, för att öka produktiviteten hos en önskad metabolit , modifierades en mikroorganism genetiskt genom kemiskt inducerad mutation , och den mutanta stam som överuttryckte den önskade metaboliten valdes sedan. Ett av huvudproblemen med denna teknik var dock att den metaboliska vägen för produktionen av den metaboliten inte analyserades, och som ett resultat var begränsningarna för produktion och relevanta enzymer som skulle modifieras okända.
På 1990-talet uppstod en ny teknik som kallas metabolic engineering. Denna teknik analyserar den metaboliska vägen för en mikroorganism och bestämmer begränsningarna och deras effekter på produktionen av önskade föreningar. Den använder sedan genteknik för att lindra dessa begränsningar. Några exempel på framgångsrik metabolisk ingenjörskonst är följande: (i) Identifiering av begränsningar för lysinproduktion i Corynebacterium glutamicum och införande av nya gener för att lindra dessa begränsningar för att förbättra produktionen (ii) Konstruktion av en ny biosyntesväg för fettsyror , kallad omvänd betaoxidation väg, som är mer effektiv än den naturliga vägen för att producera fettsyror och alkoholer som potentiellt kan omvandlas katalytiskt till kemikalier och bränslen (iii) Förbättrad produktion av DAHP , en aromatisk metabolit som produceras av E. coli som är en mellanprodukt i produktionen av aromatiska ämnen. aminosyror. Det bestämdes genom metabolisk flödesanalys att det teoretiska maximala utbytet av DAHP per använd glukosmolekyl var 3/7. Detta beror på att en del av kolet från glukos går förlorat som koldioxid, istället för att användas för att producera DAHP. Dessutom omvandlades en av metaboliterna (PEP eller fosfoenolpyruvat ) som används för att producera DAHP till pyruvat (PYR) för att transportera glukos in i cellen och var därför inte längre tillgänglig för att producera DAHP. För att lindra bristen på PEP och öka avkastningen har Patnaik et al. använde genteknik på E. coli för att introducera en reaktion som omvandlar PYR tillbaka till PEP. Således regenereras PEP som används för att transportera glukos in i cellen och kan användas för att göra DAHP. Detta resulterade i ett nytt teoretiskt maximalt utbyte på 6/7 – dubbelt så mycket som det naturliga E. coli- systemet.
I industriell skala blir ämnesomsättningstekniken mer bekväm och kostnadseffektiv. Enligt Biotechnology Industry Organisation byggs " mer än 50 bioraffinaderianläggningar över hela Nordamerika för att tillämpa metabolisk ingenjörskonst för att producera biobränslen och kemikalier från förnybar biomassa som kan bidra till att minska utsläppen av växthusgaser". Potentiella biobränslen inkluderar kortkedjiga alkoholer och alkaner (för att ersätta bensin ), fettsyrametylestrar och fettalkoholer (för att ersätta diesel ) och fettsyra- och isoprenoidbaserade biobränslen (för att ersätta diesel ).
Metabolisk ingenjörskonst fortsätter att utvecklas i effektivitet och processer med hjälp av genombrott inom området syntetisk biologi och framsteg när det gäller att förstå metabolitskador och dess reparation eller förebyggande . Tidiga metaboliska tekniska experiment visade att ackumulering av reaktiva intermediärer kan begränsa flödet i konstruerade vägar och vara skadligt för värdceller om matchande skadekontrollsystem saknas eller är otillräckliga. Forskare inom syntetisk biologi optimerar genetiska vägar, vilket i sin tur påverkar cellulär metabolisk produktion. De senaste minskningarna av kostnaden för syntetiserat DNA och utvecklingen av genetiska kretsar bidrar till att påverka förmågan hos metabolisk ingenjörskonst att producera önskad produktion.
Metaboliskt flödesanalys
En analys av metabolt flöde finns vid Fluxbalansanalys
Inrätta en metabolisk väg för analys
Det första steget i processen är att identifiera ett önskat mål att uppnå genom att förbättra eller modifiera en organisms metabolism. Referensböcker och onlinedatabaser används för att undersöka reaktioner och metaboliska vägar som kan producera denna produkt eller detta resultat. Dessa databaser innehåller riklig genomisk och kemisk information inklusive vägar för metabolism och andra cellulära processer. Med hjälp av denna forskning väljs en organism ut som ska användas för att skapa den önskade produkten eller resultatet. Överväganden som tas i beaktande när man fattar detta beslut är hur nära organismens metaboliska väg är den önskade vägen, underhållskostnaderna förknippade med organismen och hur lätt det är att modifiera organismens väg. Escherichia coli ( E. coli ) används i stor utsträckning inom metabol teknik för att syntetisera en mängd olika produkter såsom aminosyror eftersom det är relativt lätt att underhålla och modifiera. Om organismen inte innehåller hela vägen för den önskade produkten eller resultatet, måste gener som producerar de saknade enzymerna införlivas i organismen.
Analysera en metabolisk väg
Den fullbordade metaboliska vägen modelleras matematiskt för att hitta det teoretiska utbytet av produkten eller reaktionsflödena i cellen. Ett flöde är den hastighet med vilken en given reaktion i nätverket sker. Enkel analys av metabola vägar kan göras för hand, men de flesta kräver användning av programvara för att utföra beräkningarna. Dessa program använder komplexa linjära algebraalgoritmer för att lösa dessa modeller. För att lösa ett nätverk med hjälp av ekvationen för bestämda system som visas nedan måste man mata in nödvändig information om de relevanta reaktionerna och deras flöden. Information om reaktionen (såsom reaktanterna och stökiometrin) finns i matriserna G x och G m . Matriserna Vm och Vx innehåller flödena av de relevanta reaktionerna. När den är löst, ger ekvationen värdena för alla okända flöden (innefattade i V x ).
Bestämma de optimala genetiska manipulationerna
Efter att ha löst reaktionsflödena i nätverket är det nödvändigt att bestämma vilka reaktioner som kan ändras för att maximera utbytet av den önskade produkten. För att avgöra vilka specifika genetiska manipulationer som ska utföras är det nödvändigt att använda beräkningsalgoritmer, såsom OptGene eller OptFlux. De ger rekommendationer för vilka gener som bör överuttryckas, slås ut eller introduceras i en cell för att möjliggöra ökad produktion av den önskade produkten. Till exempel, om en given reaktion har särskilt lågt flöde och begränsar mängden produkt, kan programvaran rekommendera att enzymet som katalyserar denna reaktion bör överuttryckas i cellen för att öka reaktionsflödet. De nödvändiga genetiska manipulationerna kan utföras med användning av standardtekniker för molekylärbiologi. Gener kan överuttryckas eller slås ut från en organism, beroende på deras effekt på vägen och det slutliga målet.
Experimentella mätningar
För att skapa en lösbar modell är det ofta nödvändigt att ha vissa flöden som redan är kända eller experimentellt mätta. Dessutom, för att verifiera effekten av genetiska manipulationer på det metaboliska nätverket (för att säkerställa att de överensstämmer med modellen), är det nödvändigt att experimentellt mäta flödena i nätverket. För att mäta reaktionsflöden görs kolflödesmätningar med kol-13 isotopmärkning . Organismen matas med en blandning som innehåller molekyler där specifika kol är konstruerade för att vara kol-13-atomer, istället för kol-12. Efter att dessa molekyler har använts i nätverket, blir nedströms metaboliter också märkta med kol-13, eftersom de införlivar dessa atomer i sina strukturer. Det specifika märkningsmönstret för de olika metaboliterna bestäms av reaktionsflödena i nätverket. Märkningsmönster kan mätas med hjälp av tekniker såsom gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) tillsammans med beräkningsalgoritmer för att bestämma reaktionsflöden.
Se även
externa länkar
Biotechnology Industry Organisation (BIO) webbplats: