MS2-taggning

MS2-taggning är en teknik baserad på den naturliga interaktionen av MS2- bakteriofaghöljeproteinet med en stam-loop- struktur från faggenomet , som används för biokemisk rening av RNA-proteinkomplex och samarbetar med GFP för detektion av RNA i levande celler. På senare tid har tekniken använts för att övervaka uppkomsten av RNA i levande celler, vid transkriptionsstället, eller helt enkelt genom att observera förändringarna i RNA-tal i cytoplasman. Detta har avslöjat att transkription av både prokaryota och eukaryota gener sker på ett diskontinuerligt sätt med transkriptionsskurar åtskilda av oregelbundna intervall.

Procedur

Börja med enkelsträngat RNA och skapa ett mönster av stam-loop-strukturer genom att lägga till kopior av MS2 RNA-bindande sekvenser till en icke-kodande region. MS2-proteinet måste fusioneras med GFP och bindas till ett mRNA, ett komplex som innehåller MS2:s RNA-bindande sekvenskopior. MS2-GFP-fusionsproteinet uttrycktes genom att överföra det till en cell med en plasmid (Robert Singers labb). Signalen kodar inom RNA och signalnärvaron av den nukleära lokaliseringssignalen (NLS) i GFP-MS2 är två signaler som introduceras från EGFP-MS2-RNA-komplex.

MS2 biotinmärkt RNA-affinitetsrening (MS2-BioTRAP) är en in vivo-metod för att identifiera protein-RNA-interaktioner. Både RNA:t som taggade med MS2 och MS2-proteintaggen uttrycktes, och sedan användes affinitetsinteraktionen för att hjälpa processen att identifiera protein-RNA-interaktioner.

Fördelar och nackdelar

Fördelar:

MS2-BioTRAP-metoden är snabb, flexibel och enkel att installera; den skalar bra och tillåter studier av de fysiologiska förhållandena för protein-RNA-interaktionerna. MS2-taggen är också effektiv för små molekyler när ett MS2-höljeprotein används för att isolera en mängd olika ribonukleoproteinpartiklar (RNP) .

Nackdelar:

En varning för MS2-taggning är att många kopior av MS2-stamslingan inuti RNA:t måste läggas till för att producera tillräckligt med signal för att se och spåra en RNA-molekyl i kärnan. Vid spårning av mer än en RNA-sekvens i kärnan av odlade celler behövs mer än en målsekvens. Detta kan påverkas av MS2-proteinet, som har en klassisk basisk nukleär lokaliseringssignal (NLS), så det kan påverka platsen för RNA-komplexet, och kärnan skulle ha det mesta av GFP-MS2 (Robert Singers labb). Ackumuleringen av GFP-MS2 i kärnan kommer att resultera i starka nukleära fluorescenssignaler, vilket kommer att fördröja eller förhindra analysen av RNA-kärnlokalisering eftersom det kommer att hindra analysen av splitsning, RNA-redigering, kärnexport av RNA och RNA-translation. Dessutom, på grund av tillägget av taggen, kan den sekundära RNA-strukturen introducera en artefakt.

Dessutom kommer de små icke-kodande RNA (sRNA) uttrycksnivåerna och regulatoriska egenskaper att påverkas av MS2-taggen. Genom att använda MS2 som en affinitetstagg för att rena ett protein i E. coli- bakterier uttryckte forskare också MS2-MBP, som är ett MS2-höljeprotein som bär mutationer sammansmält med maltosbindande proteiner . Mutationerna förhindrade oligomerisering .