Kemotaxianalys

Processen för kemotaxi kan demonstreras med hjälp av en kapillärrörsanalys (visas ovan). De rörliga prokaryoterna kan känna av kemikalier i sin miljö och ändra sin rörlighet i enlighet därmed. När inga kemikalier är närvarande är rörelsen helt slumpmässig. När en avstötande eller lockande kemikalie är närvarande ändras rörligheten; körningarna blir längre och tumlande blir mindre frekventa så att nettorörelsen mot eller bort från kemikalien kan uppnås. Nätrörelsen kan ses i bägaren, där bakterierna samlas runt lockmedlet, och bort från repellenten. Bägaren som används i denna illustration är från Wikimedia Commons - " Laboratory Glassware - Beaker " av Amanda44.

Kemotaxianalyser är experimentella verktyg för utvärdering av kemotaktisk förmåga hos prokaryota eller eukaryota celler. En mängd olika tekniker har utvecklats. Vissa tekniker är kvalitativa - vilket tillåter en utredare att ungefär bestämma en cells kemotaktiska affinitet för en analyt - medan andra är kvantitativa , vilket möjliggör en exakt mätning av denna affinitet.

Kvalitetskontroll

I allmänhet är det viktigaste kravet att kalibrera inkubationstiden för analysen både till modellcellen och liganden som ska utvärderas. För kort inkubationstid resulterar i inga celler i provet, medan för lång tid stör koncentrationsgradienterna och mäter mer kemokinetiska än kemotaktiska svar.

De mest använda teknikerna är indelade i två huvudgrupper:

Agarplåtstekniker

Kemotaxianalyser med agarplattor

Detta sätt att utvärdera handlar om agar-agar eller gelatin innehållande halvfasta skikt gjorda före experimentet. Små brunnar skärs in i skiktet och fylls med celler och testsubstansen. Celler kan migrera mot den kemiska gradienten i det halvfasta lagret eller även under lagret. Vissa varianter av tekniken handlar också om brunnar och parallella kanaler som är sammankopplade med ett snitt i början av experimentet (PP-teknik). Radiellt arrangemang av PP-teknik (3 eller fler kanaler) ger möjlighet att jämföra kemotaktisk aktivitet hos olika cellpopulationer eller studera preferenser mellan ligander.

Räkning av celler: positiva svarsceller kunde räknas från framsidan av migrerande celler, efter färgning eller under naturliga förhållanden i ljusmikroskop.

Tvåkammartekniker

Kemotaxiska kammaranalyser

Boyden kammare

Kammare isolerade av filter är lämpliga verktyg för exakt bestämning av kemotaktiskt beteende. Pionjärtypen av dessa kammare konstruerades av Boyden. De rörliga cellerna placeras i den övre kammaren, medan vätska som innehåller testsubstansen fylls i den nedre. Storleken på de rörliga cellerna som ska undersökas bestämmer filtrets porstorlek; det är viktigt att välja en diameter som tillåter aktiv transmigrering. För modellering in vivo -förhållanden föredrar flera protokoll täckning av filter med molekyler av extracellulär matris ( kollagen , elastin etc.) Effektiviteten av mätningarna ökades genom utveckling av flerbrunnskammare (t.ex. NeuroProbe), där 24, 96, 384 prover utvärderas i parallell. Fördelen med denna variant är att flera paralleller analyseras under identiska förhållanden.

Brokammare

I en annan miljö är kamrarna anslutna sida vid sida horisontellt (Zigmond-kammare) eller som koncentriska ringar på en glidbana (Dunn-kammare). Koncentrationsgradient utvecklas på en smal förbindelsebrygga mellan kamrarna och antalet migrerande celler räknas också på ytan av bron med ljusmikroskop. I vissa fall är bron mellan de två kamrarna fylld med agar och celler måste " glida " i detta halvfasta skikt.

Kapillärtekniker

Vissa kapillärtekniker ger också ett kammarliknande arrangemang, men det finns inget filter mellan cellerna och testsubstansen. Kvantitativa resultat erhålls av flerbrunnstypen av denna sond med 4-8-12-kanalspipetter. Pipettens noggrannhet och ökat antal parallellt löpande prover är den stora fördelen med detta test.

Räkning av celler: positiva svarande celler räknas från den nedre kammaren (lång inkubationstid) eller från filtret (kort inkubationstid). För detektion av celler används generella färgningstekniker (t.ex. trypanblått ) eller speciella prober (t.ex. mt-dehydrogenasdetektion med MTT-analys). Märkta (t.ex. fluorokromer ) celler används också, i vissa analyser blir celler märkta under transmigrering av filtret.

Andra tekniker

Andra kemotaxianalystekniker

Förutom de ovan nämnda två vanligaste teknikfamiljen utvecklades ett brett utbud av protokoll för att mäta kemotaktisk aktivitet. Vissa av dem är endast kvalitativa, som aggregationstester, där små bitar av agar eller filter placeras på ett objektglas och ansamling av celler runt omkring mäts.

I en annan semikvantitativ teknik läggs celler över testsubstansen och förändringar i opalescens i det ursprungligen cellfria utrymmet registreras under inkubationstiden.

Den tredje ofta använda kvalitativa tekniken är T- labyrinten och dess anpassningar för mikroplattor. I originalversionen är en behållare borrad i en pinne fylld med celler. Sedan vrids pinnen och cellerna får kontakt med två andra behållare fyllda med olika ämnen. Inkubationen stoppas genom att återställa stiftet och cellantalet räknas från behållarna.

Dessutom, nyligen, ^{[ när? ]} mikrofluidiska enheter har använts allt oftare för att testa kvantitativt och exakt för kemotaxi.

externa länkar