Kartläggning av långdistansbegränsningar
Långdistansrestriktionskartläggning är en alternativ genomisk kartläggningsteknik till kortdistanskartläggning, även kallad finskalig kartläggning. Båda formerna använder restriktionsenzymer för att dechiffrera den tidigare okända ordningen av DNA- segment; den största skillnaden mellan de två är mängden DNA som utgör den slutliga kartan. Det okända DNA:t bryts i många mindre fragment av dessa restriktionsenzymer på specifika ställen på molekylen, och sedan kan fragmenten senare analyseras efter deras individuella storlekar. En slutlig långdistanskarta kan sträcka sig över hundratals till tusentals kilobyte genetisk data på många olika platser .
Långdistanskartorna täcker mycket stora genomiska regioner för att visa det fysiska förhållandet mellan DNA-segment som är inriktade på restriktionsenzymer. Dessa restriktionsplatser är en integrerad komponent i bildandet av långdistanskartering. Genetisk kopplingsdata kan kombineras med gelelektroforesprocedurer för att ge genordning såväl som avstånd på kromosomer . För att åstadkomma detta används den genetiska kopplingsinformationen för att skapa en teoribaserad hypotes: en som kan testas med gelelektrofores och utökade DNA-sekvenseringsprotokoll.
Konstruktion
Bildandet av en långdistansrestriktionskarta liknar en kortdistanskarta, men det finns en ökning av experimentell komplexitet när storleken på den genomiska sektionen ökar. För att börja denna process måste förstoring av DNA-mängden ske. Endonukleas-medierade långa polymeraskedjereaktioner tillåter DNA-fragment på upp till 40 kb att amplifieras. I vissa metoder är två ekvivalenter DNA begränsade på ett ställe, och en tredje ekvivalent är begränsat på båda ställena. Med tillräckligt med renat plasmid-DNA och matsmältningsenzymer Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) börja: växelspänningar kombineras med en standardgelelektrofores som resulterar i en mycket längre procedur. För att köra denna gel effektivt måste DNA av intresse kombineras med specifikt sällsynt skärande restriktionsendonukleas. Efter att ha kört gelén och avbildat den, vanligtvis i UV-ljus , kan storleken på DNA-fragmenten bestämmas. Hittills liknar denna process mycket kortdistanskartläggningstekniken.
Efter Puls-field gelelektrofores utförs en southern blotting -teknik och detektioner av specifika fragment med användning av molekylära prober sker för att fullborda produktionen av storskaliga restriktionskartor. Kartan skapas via en utarbetad och deduktiv process för att tolka data. Från PFGE och southern blotting måste en experimentator analysera de molekylära sonderna för att hitta ett fallande antal likheter i en rangordning av dessa fragment.
I några nya experiment har typen av gelelektrofores anpassats för att försöka öka upplösningen av genetisk information. Kapillärelektrofores har använts i samband med laserinducerad fluorescensdetektion för att höja processen för restriktionskartläggning. Denna typ av elektrofores fokuserar på de specifika laddningarna av joner och deras rörelse i ett elektroforetiskt fält istället för hela DNA-fragment. Fluorescensen av dessa atomer möjliggör visualisering av atomär rörelse; i huvudsak zoomar processen in på synfältet för en standardgelelektrofores.
Ansökningar
Dessa typer av restriktionskartor kan ge insikt i identifieringen av gener i många sjukdomar, vilket så småningom ökar möjligheten till framgångsrika terapier. Duchennes muskeldystrofi , cystisk fibros och retinitis pigmentosa är några av många genetiska sjukdomar som har gynnats av kartläggningen av informationsbegränsningar. Det biokemiska ursprunget för dessa sjukdomar, tillsammans med majoriteten av andra genetiska sjukdomar, är okända och detta kan hindra utvecklingen av förebyggande eller till och med symtomatisk behandling. Att veta att mutation är källan till ny genetisk variation, att kunna koppla samman det fysiska avståndet för dessa nukleotidförändringar med sjukdomsbundna strukturella nyheter är den mest relevanta tillämpningen av långväga restriktionskartläggning.
Till och med studier av sjukdomar som inte är medfödda har gynnats av kartläggning av långa begränsningar, särskilt HPV- , HIV- och vissa hormonrelaterade hjärntumörer . Organisationen som begränsningskartläggning tillhandahåller möjliggör nya experiment för att dra samband mellan genetiska skillnader och livslidande sjukdomar. Restriktionskartläggning kan ofta vara billigare än fullständig genetisk sekvensering, vilket gör det möjligt för laboratorier att visuellt representera aspekter av genomet som de annars inte skulle ha tillgång till. Framsteg inom datorprogrammering har gjort det möjligt för en del automatiserad programvara att producera potentiella begränsningskartor, vilket utgör en annan väg till visualisering när experimentkostnaderna blir för höga.
Se även
- Pulsfältsgelelektrofores , detaljerad metodik för denna specifika version av gelelektrofores