Isopeptidbindning
En isopeptidbindning är en amidbindning som kan bildas mellan en karboxylgrupp i en aminosyra och en aminogrupp i en annan. Åtminstone en av dessa sammanfogande grupper är en del av sidokedjan av en av dessa aminosyror, till skillnad från i en peptidbindning som ibland kallas en eupeptidbindning , speciellt när man diskuterar båda dessa bindningstyper i samma sammanhang för att göra en distinktion mellan de två.
Lysin har till exempel en aminogrupp på sin sidokedja och glutaminsyra har en karboxylgrupp på sin sidokedja. Dessa aminosyror bland andra liknande aminosyror kan gå samman eller med några andra aminosyror för att bilda en isopeptidbindning.
Isopeptidbindning kan också bildas mellan en y- karboxamidgrupp ( - (C=O)NH2 ) av glutamin och primär amin (RNH2 ) av någon aminosyra enligt följande
- Gln-(C=O)NH2 + RNH2 → Gln-(C=O)NH-R + NH3
Bindningsbildning kan antingen enzymkatalyseras , som i fallet för isopeptidbindningen som bildas mellan lysin och glutamin katalyserad av transglutaminaser (deras reaktion liknar reaktionen ovan), eller så kan den bildas spontant som observerats i HK97 bakteriofagkapsidbildning och gram- positiv bakteriell pili. Spontan isopeptidbindningsbildning kräver närvaron av en annan rest, glutaminsyra, som katalyserar bindningsbildning på ett närhetsinducerat sätt.
Ett exempel på en liten peptid som innehåller en isopeptidbindning är glutation , som har en bindning mellan sidokedjan av en glutamatrest och aminogruppen i en cysteinrest. Ett exempel på ett protein som är involverat i isopeptidbindning är ubiquitin , som binds till andra proteiner med en bindning mellan den C-terminala glycinresten av ubiquitin och en lysinsidokedja av substratproteinet.
Biosignalering och biostrukturella roller
Funktionen hos enzymgenererade isopeptidbindningar kan grovt delas in i två separata kategorier; signalering och struktur. I fallet med den förra kan dessa vara ett brett spektrum av funktioner, som påverkar proteinfunktionen, kromatinkondensationen eller halveringstid för proteinet. När det gäller den senare kategorin kan isopeptider spela en roll i en mängd olika strukturella aspekter, från att hjälpa till att bilda blodpropparna vid sårläkning, roller i extracellulär matrisvård & apoptosväg, roller i bildandet av patogent pilin, omstrukturering av aktinskelett i en värdcell för att hjälpa till med patogeniciteten hos V. cholerae, och modifiera egenskaperna av mikrotubilin för att påverka dess roll i en cells struktur.
Kemin som är involverad i bildandet av dessa isopeptidbindningar tenderar också att falla inom dessa två kategorier. I fallet med ubiquitin och ubiquitin-liknande proteiner tenderar de att ha en strukturerad väg för att kontinuerligt passera längs peptiden med en serie reaktioner, med användning av flera mellanliggande enzymer för att nå målproteinet för konjugeringsreaktionen. De strukturella enzymerna, även om de varierar från bakteriella och eukaryota domäner, tenderar att vara enstaka enzymer som vanligtvis i ett enda steg smälter samman de två substraten för en större repetitiv process för att länka och sammanlänka nämnda substrat för att bilda och påverka stora makromolekylära strukturer.
Kemi av enzymatiska bindningar
Biosignalbindningskemi
Kemin för bildandet av isopeptidbindningar är uppdelade på samma sätt som deras biologiska roller. När det gäller isopeptider som används för att konjugera ett protein till ett annat för signaltransduktion, domineras litteraturen generellt av det mycket välstuderade ubiquitinproteinet och relaterade proteiner. Även om det finns många relaterade proteiner till ubiquitin, såsom SUMO, Atg8, Atg12 och så vidare, tenderar de alla att följa relativt samma proteinligeringsväg.
Därför är det bästa exemplet att titta på ubiquitin, eftersom även om det kan finnas vissa skillnader, är ubiquitin i huvudsak den modell som följs i alla dessa fall. Processen har i huvudsak tre nivåer, i det inledande steget aktiverar det aktiverande proteinet i allmänhet som E1 Ubiquitin-proteinet genom att adenylera det med ATP. Sedan aktiveras det adenylerade ubiquitinet väsentligen och kan överföras till ett konserverat cystein med användning av en tioesterbindning som är mellan karboxylgruppen i det c-terminala glycinet i ubiquitinet och svavlet i El-cysteinet. Det aktiverande E1-enzymet binder sedan med och överför Ubiquitinet till nästa nivå, E2-enzymet som accepterar proteinet och återigen bildar en tioester med en konserverad bindning. E2 fungerar i viss utsträckning som en mellanhand som sedan binder till E3-enzymligas för den sista nivån, vilket leder till den slutliga överföringen av det ubiquitin eller ubiquitin-relaterade proteinet till ett lysinställe på målproteinet, eller mer vanligt för ubiquitin, till ubiquitin själv för att bilda kedjor av nämnda protein.
Men i den sista nivån finns det också en divergens, i det att beroende på typen av E3-ligas kanske det faktiskt inte orsakar konjugationen. Eftersom det finns E3-ligaser som innehåller HECT-domäner, där de fortsätter denna "överföringskedja" genom att återigen acceptera ubiquitinet via ett annat konserverat cystein och sedan rikta det och överföra det till det önskade målet. Men i fallet med RING-fingerdomäner som använder koordinationsbindningar med zinkjoner för att stabilisera sina strukturer, verkar de mer för att styra reaktionen. Med det menas det att när RINGfingret E3-ligas binder till E2 som innehåller ubiquitinet, fungerar det helt enkelt som en målinriktad enhet som styr E2 att direkt ligera målproteinet vid lysinstället.
Även om ubiquitin i det här fallet representerar andra proteiner som är relaterade till det väl, kommer varje protein uppenbarligen att ha sina egna olägenheter som SUMO, som tenderar att vara RING-fingerdomänligaser, där E3 helt enkelt fungerar som målinriktad enhet för att styra ligeringen av E2, och faktiskt inte utföra själva reaktionen såsom Ubiquitin E3-HECT-ligaserna. Så medan de interna mekanismerna skiljer sig åt, såsom hur proteiner deltar i överföringskedjan, förblir de allmänna kemiska aspekterna såsom användning av tioestrar och specifika ligaser för målsökning desamma.
Biostrukturell bindningskemi
Den enzymatiska kemin som är involverad i bildningen av isopeptider för strukturella ändamål skiljer sig från fallet med ubiquitin och ubiquitinrelaterade proteiner. I det, istället för sekventiella steg som involverar flera enzymer, för att aktivera, konjugera och målinrikta substratet. Katalysen utförs av ett enzym och det enda prekursorsteget, om det finns ett, är i allmänhet klyvning för att aktivera det från en zymogen. Den enhetlighet som finns i ubiquitinets fall är dock inte så här, eftersom det finns många olika enzymer som alla utför reaktionen för att bilda isopeptidbindningen.
Det första fallet är sortaserna, en enzymfamilj som är spridd över många grampositiva bakterier. Det har visat sig vara en viktig patogenicitets- och virulensfaktor. Den allmänna reaktionen som utförs av sortaser innebär att man använder sitt eget märke av den "katalytiska triaden": det vill säga att man använder histidin, arginin och cystein för den reaktiva mekanismen. His och Arg hjälper till att skapa den reaktiva miljön, och Cys fungerar återigen som reaktionscentrum genom att använda en tioester som hjälper till att hålla en karboxylgrupp tills aminen i en lysin kan utföra en nukleofil attack för att överföra proteinet och bilda isopeptidbindningen. En jon som ibland kan spela en viktig men indirekt roll i den enzymatiska reaktionen är kalcium, som är bundet av sortas. Det spelar en viktig roll för att hålla enzymets struktur i optimal konformation för katalys. Det finns dock fall där kalcium har visat sig vara icke-nödvändigt för att katalys ska kunna äga rum.
En annan aspekt som särskiljer sortaser i allmänhet är att de har en mycket specifik inriktning på sitt substrat, eftersom sortaser generellt har två funktioner, den första är sammansmältningen av proteiner till bakteriens cellvägg och den andra är polymerisationen av pilin. För processen för lokalisering av proteiner till cellväggen finns det ett trefaldigt krav på att proteinet innehåller en hydrofob domän, en positivt laddad svansregion och slutlig specifik sekvens som används för igenkänning. Den bäst studerade av dessa signaler är LPXTG, som fungerar som klyvningspunkten, där sortaset attackerar mellan Thr och Gly och konjugerar till Thr-karboxylgruppen. Därefter löses tioestern upp genom överföring av peptiden till en primär amin, och denna har generellt mycket hög specificitet, vilket ses i exemplet B. cereus där sortas D-enzymet hjälper till att polymerisera BcpA-proteinet via två igenkänningssignaler LPXTG som klyvnings- och tioesterbildande punkt, och YPKN-stället som fungerar som igenkänningssignalen där isopeptiden kommer att bildas. Även om detaljerna kan variera mellan bakterier, förblir grunderna för sortas enzymkemi desamma.
Nästa fall är det med transglutaminaser (TGaser), som huvudsakligen verkar inom eukaryoter för att smälta samman olika proteiner av en mängd olika anledningar, såsom sårläkning eller bindning av proteiner till lipidmembran. TGaserna själva innehåller också sin egen "katalytiska triad" med histidin, aspartat och cystein. Rollerna för dessa rester är analoga eller samma som de tidigare beskrivna sortaserna, genom att His och Asp spelar en stödjande roll i interaktionen med målresten, medan Cys bildar en tioester med en karboxylgrupp för en senare nukleofil attack av en primär amin, i detta fall på grund av intresset för lysin. Även om likheterna med sortas katalytiskt börjar sluta där, eftersom enzymet och familjen är beroende av kalcium, vilket spelar en avgörande strukturell roll för att hålla en stram konformation av enzymet. TGaserna har också en mycket annorlunda substratspecificitet genom att de riktar sig specifikt mot mitten Gln, i sekvensen "Gln-Gln-Val". Den allmänna substratspecificiteten, dvs det specifika proteinet beror på den allmänna strukturen hos olika TGaser som riktar dem till substratet.
Specificiteten har noterats i TGaser så att olika TGaser kommer att reagera med olika Gln på samma protein, vilket betyder att enzymerna har en mycket specifik initial inriktning. Det har också visat sig ha viss specificitet beträffande vilket mål-lysin det överför proteinet till, som i fallet med faktor XIII, där den intilliggande resten till Lys avgör om reaktionen kommer att inträffa. Så även om TGaserna initialt kan verka som ett eukaryot sortas, står de för sig själva som en separat uppsättning enzymer.
Ett annat fall av ett isopeptidbindande enzym för strukturella ändamål är aktin-tvärbindningsdomänen (ACD) av MARTX-toxinproteinet som genereras av V. cholerae. Även om det har visat sig att ACD när den utför katalysen använder magnesium och ATP för bildandet av tvärbindningarna är mekanismens detaljer osäkra. Även om en intressant aspekt av tvärbindningen som bildas i detta fall är att den använder en icke-terminal Glu för att ligera till en icke-terminal Lys, vilket verkar vara sällsynt i processen att bilda en isopeptidbindning. Även om kemin för ACD fortfarande måste lösas, visar den att isopeptidbindningsbildning inte är beroende helt enkelt av Asp/Asn för icke-terminala isopeptidkopplingar mellan proteiner.
Det sista fallet som ska undersökas är det märkliga fallet med posttranslationella modifieringar av mikrotubilin (MT). MT innehåller ett brett utbud av post translationella modifieringar; de två av de mest uppskattade intressena är emellertid polyglutamylering och polyglycylering. Båda modifieringarna liknar varandra i den meningen att de är upprepande sträckor av samma aminosyra sammansmält med sidokedjekarboxylgruppen av glutamat vid den c-terminala regionen av MT. De enzymatiska mekanismerna är inte helt färdiga eftersom inte mycket är känt om det polyglykerande enzymet. När det gäller polyglutamylering är den exakta mekanismen också okänd, men den verkar vara ATP-beroende. Även om det återigen finns en brist på klarhet med avseende på den enzymatiska kemin, finns det fortfarande värdefull insikt i bildandet av isopeptidbindningar med användning av R-gruppens karboxyl av Glu i samband med den N-terminala aminon hos de modifierande peptiderna.
Spontan bildning
Forskare har utnyttjat spontan bildning av isopeptidbindningar för att utveckla en peptidtagg som kallas SpyTag . SpyTag kan spontant och irreversibelt reagera med sin bindningspartner (ett protein som kallas SpyCatcher) genom en kovalent isopeptidbindning. Detta molekylära verktyg kan ha tillämpningar för in vivo- proteininriktning, fluorescerande mikroskopi och irreversibel fästning för en proteinmikroarray . Efter detta utvecklades andra Tag/Catcher-system som SnoopTag/SnoopCatcher och SdyTag/SdyCatcher som kompletterar SpyTag/SpyCatcher.