Intravital mikroskopi
Intravital mikroskopi är en form av mikroskopi som gör det möjligt att observera biologiska processer i levande djur ( in vivo ) med en hög upplösning som gör det möjligt att skilja mellan enskilda celler i en vävnad .
Hos däggdjur utförs i vissa experimentmiljöer en kirurgisk implantation av ett bildfönster före intravital mikroskopi. Detta tillåter upprepade observationer under flera dagar eller veckor. Till exempel, om forskare vill visualisera leverceller från en levande mus kommer de att implantera ett bildfönster i musens buk . Möss är det vanligaste valet av djur för intravital mikroskopi men i speciella fall kan andra gnagare som råttor vara mer lämpliga. Djur är vanligtvis sövda under operationer och bildbehandlingssessioner. Intravital mikroskopi används inom flera forskningsområden, inklusive neurologi , immunologi , stamcellsstudier och andra. Denna teknik är särskilt användbar för att bedöma en utveckling av en sjukdom eller en effekt av ett läkemedel.
Grundläggande koncept
Intravital mikroskopi innebär att avbilda celler av ett levande djur genom ett bildfönster som implanteras i djurvävnaden under en speciell operation. Den största fördelen med intravital mikroskopi är att den tillåter avbildning av levande celler medan de befinner sig i den verkliga miljön av en komplex flercellig organism . Således tillåter intravital mikroskopi forskare att studera beteendet hos celler i deras naturliga miljö eller in vivo snarare än i en cellkultur . En annan fördel med intravital mikroskopi är att experimentet kan sättas upp på ett sätt som gör det möjligt att observera förändringar i en levande vävnad hos en organism över en tidsperiod. Detta är användbart för många forskningsområden, inklusive immunologi och stamcellsforskning. Hög kvalitet på moderna mikroskop och bildbehandlingsprogram tillåter också subcellulär avbildning i levande djur som i sin tur gör det möjligt att studera cellbiologi på molekylär nivå in vivo . Framsteg inom fluorescerande proteinteknologi och genetiska verktyg som möjliggör kontrollerat uttryck av en given gen vid en specifik tidpunkt i en vävnad av intresse spelade också en viktig roll i utvecklingen av intravital mikroskopi.
Möjligheten att generera lämpliga transgena möss är avgörande för intravitala mikroskopistudier. Till exempel, för att studera beteendet hos mikrogliaceller i Alzheimers sjukdom kommer forskare att behöva korsa en transgen mus som är en musmodell av Alzheimers sjukdom med en annan transgen mus som är en musmodell för visualisering av mikrogliaceller. Celler behöver producera ett fluorescerande protein för att visualiseras och detta kan uppnås genom att introducera en transgen .
Avbildning
Intravital mikroskopi kan utföras med hjälp av flera ljusmikroskopitekniker inklusive widefield fluorescens, konfokal , multifoton , spinning disc mikroskopi och andra. Det huvudsakliga övervägandet för valet av en viss teknik är penetrationsdjupet som behövs för att avbilda området och mängden cell-cell-interaktionsdetaljer som krävs.
Om området av intresse är beläget mer än 50–100 µm under ytan eller det finns ett behov av att fånga småskaliga interaktioner mellan celler, krävs multifotonmikroskopi. Multifotonmikroskopi ger betydligt större penetrationsdjup än konfokalmikroskopi med en foton. Multifotonmikroskopi gör det också möjligt att visualisera celler som är belägna under benvävnad, såsom celler i benmärgen . Det maximala djupet för avbildningen med multifotonmikroskopi beror på de optiska egenskaperna hos vävnaden och experimentell utrustning. Ju mer homogen vävnaden är desto bättre lämpar den sig för intravital mikroskopi. Mer vaskulariserade vävnader är i allmänhet svårare att avbilda eftersom röda blodkroppar orsakar absorption och spridning av mikroskopets ljusstråle.
Fluorescensmärkning av olika cellinjer med olikfärgade proteiner möjliggör visualisering av celldynamik i en kontext av deras mikromiljö . Om bildupplösningen är tillräckligt hög (50 – 100 μm) kan det vara möjligt att använda flera bilder för att generera 3D-modeller av cellulära interaktioner, inklusive utsprång som celler gör medan de sträcker sig mot varandra. 3D-modeller från time-lapse- bildsekvenser gör det möjligt att bedöma hastighet och riktning av cellulära rörelser. Vaskulära strukturer kan också rekonstrueras i 3D-rymden och förändringar av deras permeabilitet kan övervakas under en tidsperiod eftersom fluorescerande signalintensitet för färgämnen ändras när vaskulär permeabilitet gör det. Högupplöst intravital mikroskopi kan användas för att visualisera spontana och övergående händelser. Det kan vara användbart att koppla ihop multifoton- och konfokalmikroskopi eftersom detta gör det möjligt att få mer information från varje bildbehandlingssession. Detta inkluderar visualisering av fler olika celltyper och strukturer för att få mer informativa bilder och att använda ett enda djur för att få bilder av alla olika celltyper och strukturer som är av intresse för ett givet experiment. Det senare är ett exempel på implementeringen av Three Rs -principen.
Avbildning av subcellulära strukturer
Tidigare kunde intravital mikroskopi endast användas för att avbilda biologiska processer på vävnads- eller encellsnivå. Men på grund av utvecklingen av subcellulära märkningstekniker och framsteg för att minimera rörelseartefakter (fel som genereras av hjärtslag, andetag och peristaltiska rörelser hos ett djur under avbildningssession) blir det nu möjligt att avbilda dynamiken hos intracellulära organeller i vissa vävnader.
Begränsningar av intravital mikroskopi
En av de främsta fördelarna med intravital mikroskopi är möjligheten att observera hur celler interagerar med sin mikromiljö . Emellertid är visualisering av alla celltyper i mikromiljön begränsad av antalet tillgängliga särskiljbara fluorescerande etiketter . Det är också allmänt accepterat att vissa vävnader som hjärnan kan visualiseras lättare än andra som skelettmuskler . Dessa skillnader uppstår på grund av variation i homogenitet och transparens hos olika vävnader. Dessutom är det ofta utmanande och tidskrävande att generera transgena möss med en fenotyp av intresse och fluorescerande proteiner i lämpliga celltyper. Ett annat problem förknippat med användningen av transgena möss är att det ibland är svårt att tolka förändringar som observeras mellan en vildtypsmus och en transgen mus som representerar fenotypen av intresse. Anledningen till detta är att gener med liknande funktion ofta kan kompensera för den förändrade gen som leder till en viss grad av anpassning.
externa länkar
-
Media relaterade till Intravital mikroskopi på Wikimedia Commons
