Interferensreflektionsmikroskopi

Princip för interferensreflektionsmikroskopi (IRM) som visar interferenseffekt på reflekterade vågor och resultatet på den slutliga bildintensiteten. Mörklila våg representerar ljuset från ljuskällan. De ljuslila vågorna är reflektionerna från cellmembranet och från glasytan. När de träffar glasytan förskjuts de reflekterade vågorna en halv våglängd. När membranet är mycket nära glaset kommer det reflekterade ljuset att reflekteras ur fas med den reflekterade strålen från glaset. Detta kommer att orsaka destruktiv interferens (se röd linje), vilket resulterar i en mörk pixel. Om det finns mer avstånd mellan membranet och glaset kommer de återkommande vågorna att förskjutas mindre och orsaka konstruktiv interferens (se röd linje), vilket resulterar i en ljusare pixel i den slutliga bilden. Indikerade är de typiska brytningsindexen för glaset, mediet och cellmembranet, som bestämmer mängden reflektion.

Interferensreflektionsmikroskopi ( IRM ), även kallad Reflection Interference Contrast Microscopy ( RICM ) eller Reflection Contrast Microscopy ( RCM ) beroende på sammanhanget, är en optisk mikroskopiteknik som utnyttjar interferenseffekter för att bilda en bild av ett objekt på en glasyta. Signalens intensitet är ett mått på objektets närhet till glasytan . Denna teknik kan användas för att studera händelser vid cellmembranet utan användning av en (fluorescerande) märkning som är fallet för TIRF-mikroskopi .

Historia och namn

År 1964 myntade Adam SG Curtis termen Interference Reflection Microscopy ( IRM ) och använde den inom cellbiologi för att studera embryonala kycklinghjärtafibroblaster. Han använde IRM för att titta på vidhäftningsställen och avstånd för fibroblaster, och noterade att kontakten med glaset mestadels var begränsad till cellperiferin och pseudopodien .

1975 introducerade Johan Sebastiaan Ploem en förbättring av IRM (publicerad i ett bokkapitel), som han kallade Reflection Contrast Microscopy ( RCM ). Förbättringen är att använda ett så kallat anti-flex objektiv och korsade polarisatorer för att ytterligare reducera ströljus i det optiska systemet. Idag kallas detta schema främst för Reflection Interference Contrast Microscopy ( RICM ), vars namn introducerades av Bareiter-Hahn och Konrad Beck 1979.

Men termen IRM är ibland för att beskriva en RICM-uppställning. Mångfalden av namn som används för att beskriva tekniken har orsakat viss förvirring, och diskuterades så tidigt som 1985 av Verschueren.

Bareiter-Hahn och Konrad Beck korrelerade tekniken med elektronmikroskopi , vilket visar att olika däggdjurscellinjer fäster vid glassubstratet i specifika fokala vidhäftningsställen.

Teori

För att bilda en bild av den fästa cellen leds ljus med en specifik våglängd genom en polarisator . Detta linjärt polariserade ljus reflekteras av en stråldelare mot objektivet , som fokuserar ljuset på provet. Glasytan är reflekterande till en viss grad och kommer att reflektera det polariserade ljuset. Ljus som inte reflekteras av glaset kommer att färdas in i cellen och reflekteras av cellmembranet. Tre situationer kan uppstå. För det första, när membranet är nära glaset, förskjuts det reflekterade ljuset från glaset till hälften av en våglängd, så att ljus som reflekteras från membranet kommer att ha en fasförskjutning jämfört med det reflekterade ljuset från glasfaserna och därför upphäver varandra ut ( interferens ). Denna interferens resulterar i en mörk pixel i den slutliga bilden (vänster fallet i figuren). För det andra, när membranet inte är fäst vid glaset, har reflektionen från membranet en mindre fasförskjutning jämfört med det reflekterade ljuset från glaset, och därför kommer de inte att ta bort varandra, vilket resulterar i en ljus pixel i bilden ( rätt fall i figuren). För det tredje, när det inte finns något prov, detekteras endast det reflekterade ljuset från glaset och kommer att visas som ljusa pixlar i den slutliga bilden.

Det reflekterade ljuset kommer att gå tillbaka till stråldelaren och passera genom en andra polarisator, som eliminerar spritt ljus, innan det når detektorn (vanligtvis en CCD-kamera ) för att bilda den slutliga bilden. Polarisatorerna kan öka effektiviteten genom att minska spritt ljus; men i en modern installation med en känslig digitalkamera krävs de inte.

Teori

Reflektion orsakas av en förändring i brytningsindex, så på varje gräns kommer en del av ljuset att reflekteras. Mängden reflektion ges av reflektionskoefficienten $r_{12}\!$ , enligt följande regel:

$r_{12}={\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}$

Reflexivitet $R\!$ är ett förhållande mellan den reflekterade ljusintensiteten ( $I_{r}\!$ ) och den inkommande ljusintensiteten ( $I_{i}\!$ ) :

$R={\frac {I_{r}}{I_{i}}}=\left\lbrack {\frac {n_{1}-n_{2}}{n_{1}+n_{2}}}\right\rbrack ^{2}={r_{12}}^{2}$

Med hjälp av typiska brytningsindex för glas (1,50-1,54, se lista ), vatten (1,31, se lista ), cellmembranet (1,48) och cytosolen (1,35), kan man beräkna andelen ljus som reflekteras av varje gränssnitt. Mängden reflektion ökar när skillnaden mellan brytningsindex ökar, vilket resulterar i en stor reflektion från gränsytan mellan glasytan och odlingsmediet (ungefär lika med vatten: 1,31-1,33). Det betyder att utan en cell blir bilden ljus, medan när cellen är fäst, orsakar skillnaden mellan medium och membran en stor reflektion som är något förskjuten i fas, vilket orsakar störning av ljuset som reflekteras av glaset. Eftersom amplituden för ljuset som reflekteras från gränsytan mellan medium och membran minskar på grund av spridning, kommer det fästa området att se mörkare ut men inte helt svart. Eftersom ljuskonen fokuserad på provet ger upphov till olika vinklar av infallande ljus, finns det ett brett spektrum av interferensmönster. När mönstren skiljer sig med mindre än 1 våglängd (nollordningens rand), konvergerar mönstren, vilket resulterar i ökad intensitet. Detta kan uppnås genom att använda ett objektiv med en numerisk bländare större än 1.

Krav

För att avbilda celler med IRM behöver ett mikroskop åtminstone följande element: 1) en ljuskälla, såsom en halogenlampa, 2) ett optiskt filter (som passerar ett litet våglängdsområde) och 3) en stråldelare (som reflekterar 50 % och sänder ut 50 % av den valda våglängden).

Ljuskällan behöver producera ljus med hög intensitet, eftersom mycket ljus kommer att förloras av stråldelaren och själva provet. Olika våglängder resulterar i olika IRM-bilder; Bereiter-Hahn och kollegor visade att för deras PtK 2-celler resulterade ljus med en våglängd på 546 nm i bättre kontrast än blått ljus med en våglängd på 436 nm. Det har gjorts många förbättringar av den grundläggande teorin om IRM, varav de flesta ökar effektiviteten och utbytet av bildbildningen. Genom att placera polarisatorer och en kvartsvågsplatta mellan stråldelaren och provet kan det linjärt polariserade ljuset omvandlas till cirkulärt polariserat ljus och sedan omvandlas tillbaka till linjärt polariserat ljus, vilket ökar effektiviteten i systemet. Den cirkulära polarisatorartikeln diskuterar denna process i detalj. Dessutom, genom att inkludera en andra polarisator, som roteras 90° jämfört med den första polarisatorn, kan ströljus förhindras från att nå detektorn, vilket ökar signal/brusförhållandet (se figur 2 i Verschueren).

Biologiska tillämpningar

Det finns flera sätt som IRM kan användas för att studera biologiska prover. Tidiga exempel på användningar av tekniken fokuserade på cellvidhäftning och cellmigration .

Vesikelfusion

Två kromaffinceller avbildade med DIC (vänster) och IRM (höger).

Vesikelfusion visualiserad med IRM. Skalstapeln representerar 2 μm.

På senare tid har tekniken använts för att studera exocytos i kromaffinceller . När de avbildas med DIC visas kromaffinceller som runda celler med små utsprång. När samma cell avbildas med IRM kan cellens fotavtryck på glaset tydligt ses som ett mörkt område med små utsprång. När vesiklar smälter samman med membranet visas de som små ljusa cirklar inom det mörka fotavtrycket (ljusa fläckar i den översta cellen i den högra panelen).

Ett exempel på vesikelfusion i kromaffinceller med IRM visas i film 1. Vid stimulering med 60 mM kalium börjar flera ljusa fläckar uppträda inuti kromaffincellens mörka fotavtryck som ett resultat av exocytos av täta kärngranuler. Eftersom IRM inte kräver en fluorescerande märkning, kan den kombineras med andra avbildningstekniker, såsom epifluorescens och TIRF-mikroskopi för att studera proteindynamik tillsammans med vesikelexocytos och endocytos. En annan fördel med avsaknaden av fluorescerande märkningar är minskad fototoxicitet .

Vidare läsning

Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion , Laurent Limozin och Kheya Sengupta, ChemPhysChem 2009, 10 , 2752–2768.

externa länkar