FMN-bindande fluorescerande protein

Typisk kärndomän för en FbFP (​)

Ett FMN-bindande fluorescerande protein ( FbFP ), även känt som ett LOV-baserat fluorescerande protein , är ett litet, syreoberoende fluorescerande protein som binder flavinmononukleotid (FMN) som en kromofor .

De utvecklades från blåljusreceptorer (så kallade LOV-domäner ) som finns i växter och olika bakterier. De kompletterar GFP -derivaten och -homologerna och kännetecknas särskilt av deras oberoende av molekylärt syre och deras ringa storlek. FbFPs absorberar blått ljus och avger ljus i det cyangröna spektralområdet.

Utveckling

LOV-domäner är en underklass av PAS-domäner och identifierades först i växter som en del av Phototropin , som spelar en väsentlig roll i växtens tillväxt mot ljus. De binder icke-kovalent Flavinmononukleotid (FMN) som koenzym. På grund av det bundna FMN uppvisar LOV-domäner en inneboende fluorescens, som dock är mycket svag. Vid belysning med blått ljus genomgår LOV-domäner en fotocykel, under vilken en kovalent bindning bildas mellan en konserverad cysteinrest och FMN. Detta orsakar en konformationsförändring i proteinet som är nödvändig för signalförökning och leder också till förlust av fluorescens. Den kovalenta bindningen är energetiskt ogynnsam och klyvs med en proteinspecifik tidskonstant som sträcker sig från sekunder till timmar. För att bättre kunna utnyttja fluorescensegenskaperna hos dessa proteiner avskaffades den naturliga fotocykeln för dessa LOV-domäner genom att utbyta det konserverade cysteinet mot en alanin på genetisk nivå. Sålunda, vid bestrålning med blått ljus, förblir proteinet i det fluorescerande tillståndet och uppvisar också en ljusare fluorescens.

De första FbFP:erna som genererades på detta sätt optimerades därefter ytterligare med hjälp av olika metoder för mutagenes. Speciellt ljusstyrkan men även fotostabiliteten hos proteinerna förbättrades och deras spektrala egenskaper förändrades.

Spektrala egenskaper

Typiskt excitations- och emissionsspektrum av FMN-bindande fluorescerande proteiner (FbFP)

Typiskt har FbFP:er ett excitationsmaximum vid en våglängd på cirka 450 nm (blått ljus) och en andra distinkt excitationstopp runt 370 nm (UV-A-ljus). Den huvudsakliga utsläppstoppen ligger på ca. 495 nm, med en axel runt 520 nm. En variant av Pp2FbFP (Q116V) uppvisar ett 10 nm blått skifte i både excitations- och emissionsspektra. Rationellt utformade varianter av iLOV och CagFbFP uppvisar 6 respektive 7 nm röda skift.

Fotofysiska egenskaper

De fotofysiska egenskaperna hos FbFP:erna bestäms av kromoforen själv och dess kemiska omgivning i proteinet. Extinktionskoefficienten (ε) är runt 14.200 M ⁻¹ cm ⁻¹ vid 450 nm för alla beskrivna FbFPs, vilket är något högre än den för fritt FMN (ε = 12.200 M −1 ^cm −1 ⁾ . Fluorescens- kvantutbytet (Φ) varierar signifikant mellan olika FbFP:er och sträcker sig från 0,2 (phiLOV2.1) till 0,44 (EcFbFP och iLOV). Detta representerar en nästan fördubblad ökning jämfört med fritt FMN (Φ = 0,25). Skillnaden mot fritt FMN är ännu mer signifikant när det gäller fotostabiliteten, proteinernas motståndskraft mot blekning under långvarig och intensiv bestrålning med blått ljus. Baserat på blekningshalvtiden (de tider det tar att minska den initiala fluorescensintensiteten till 50 % vid belysning) är den genetiskt modifierade varianten phiLOV2.1 ungefär 40 gånger så stabil som fri FMN. Denna stabiliserande effekt kan observeras för nästan alla FbFPs, även om den vanligtvis ligger i intervallet 5x - 10x. Den genomsnittliga fluorescenslivslängden för FbFP är i intervallet 3,17 (Pp2FbFP) och 5,7 ns (t.ex. EcFbFP). De är därmed mycket längre än de av GFP-derivat, som vanligtvis är mellan 1,5 och 3 ns. FbFP: er är därför väl lämpade som donatordomäner i Förster resonance energy transfer (FRET) system i kombination med GFP-derivat som YFP som acceptordomäner.

Fördelar och nackdelar

Den största fördelen med FbFPs jämfört med GFP är deras oberoende av molekylärt syre. Eftersom alla GFP-derivat och homologer kräver molekylärt syre för att mogna sin kromofor, är dessa fluorescerande proteiner av begränsad användning under anaeroba eller hypoxiska förhållanden. Eftersom FbFP binder FMN som kromofor, som syntetiseras oberoende av molekylärt syre, skiljer sig deras fluorescenssignal inte mellan aeroba och anaeroba förhållanden. En annan fördel är den lilla storleken på FbFP, som vanligtvis är mellan 100 och 150 aminosyror . Detta är ungefär hälften så stort som GFP (238 aminosyror). Det kan till exempel visas att detta gör dem till överlägsna taggar för övervakning av tobaksmosaikvirusinfektioner i tobaksblad. På grund av sin extraordinära långa genomsnittliga fluorescenslivslängd på upp till 5,7 ns är de också mycket väl lämpade för användning som donatordomäner i FRET-system i samband med t.ex. YFP (se fotofysiska egenskaper). En fusion av EcFbFP och YFP användes till exempel för att utveckla den första genetiskt kodade fluorescensbiosensorn för syre (FluBO)

Den största nackdelen jämfört med GFP-varianter är deras lägre ljusstyrka (produkten av ε och Φ). Den vanligen använda EGFP (ε = 55 000 M ⁻¹ cm ⁻¹ ; Φ = 0,60 ) är till exempel ungefär fem gånger så ljus som EcFbFP. En annan nackdel med FbFPs är bristen på färgvarianter för att märka och särskilja flera proteiner i en enda cell eller vävnad. Det största spektralskiftet som rapporterats för FbFPs hittills är 10 nm. Även om denna variant (Pp2FbFP Q116V) visuellt kan särskiljas från de andra med det mänskliga ögat, är de spektrala skillnaderna för små för fluorescensmikroskopifilter.