Exon hoppar över
Inom molekylärbiologi är exonhoppning en form av RNA-skarvning som används för att få celler att "hoppa" över felaktiga eller felinriktade avsnitt ( exoner ) av genetisk kod, vilket leder till ett trunkerat men fortfarande funktionellt protein trots den genetiska mutationen.
Mekanism
Exon-hoppning används för att återställa läsramen i en gen. Gener är de genetiska instruktionerna för att skapa ett protein och är sammansatta av introner och exoner . Exoner är de sektioner av DNA som innehåller instruktionsuppsättningen för att generera ett protein; de är varvat med icke-kodande regioner som kallas introner. Intronerna avlägsnas senare innan proteinet tillverkas, vilket bara lämnar de kodande exonregionerna.
Splitsning sker naturligt i pre-mRNA när introner tas bort för att bilda moget-mRNA som enbart består av exoner. Från och med slutet av 1990-talet insåg forskare att de kunde dra fördel av denna naturligt förekommande cellulära skarvning för att tona ner genetiska mutationer till mindre skadliga.
Mekanismen bakom exonhoppning är en mutationsspecifik antisensoligonukleotid (AON). En antisens-oligonukleotid är en syntetiserad kort nukleinsyrapolymer, typiskt femtio eller färre baspar långa, som kommer att binda till mutationsstället i pre-budbärar-RNA:t för att inducera exon-hoppning. AON binder till det muterade exonet, så att när genen sedan översätts från det mogna mRNA:t "hoppas" den över, vilket återställer den störda läsramen. Detta möjliggör generering av ett internt raderat, men till stor del funktionellt protein.
Vissa mutationer kräver exonhoppning på flera platser, ibland intill varandra, för att återställa läsramen. Överhoppning av flera exoner har framgångsrikt genomförts med en kombination av AON som riktar sig mot flera exoner.
Som behandling för Duchennes muskeldystrofi
Exon skipping forskas hårt för behandling av Duchennes muskeldystrofi (DMD), där muskelproteinet dystrofin trunkeras i förtid, vilket leder till ett icke-fungerande protein. Framgångsrik behandling genom exon-hoppning kan leda till ett mestadels funktionellt dystrofinprotein och skapa en fenotyp som liknar den mindre allvarliga Beckers muskeldystrofin (BMD).
När det gäller Duchennes muskeldystrofi är proteinet som blir äventyrat dystrofin. Dystrofinproteinet har två väsentliga funktionella domäner som flankerar en central stavdomän som består av repetitiva och delvis dispenserbara segment. Dystrofins funktion är att upprätthålla muskelfiberstabilitet under kontraktion genom att koppla den extracellulära matrisen till cytoskelettet. Mutationer som stör den öppna läsramen inom dystrofin skapar för tidigt trunkerade proteiner som inte kan utföra sitt jobb. Sådana mutationer leder till muskelfiberskada, ersättning av muskelvävnad med fett och fibrotisk vävnad och för tidig död som vanligtvis inträffar i början av tjugotalet av DMD-patienter. Jämförelsevis leder mutationer som inte rubbar den öppna läsramen till ett dystrofinprotein som är internt deleterat och kortare än normalt, men fortfarande delvis funktionellt. Sådana mutationer är förknippade med den mycket mildare Beckers muskeldystrofin. Milt påverkade BMD-patienter som bär på deletioner som involverar över två tredjedelar av den centrala stavdomänen har beskrivits, vilket tyder på att denna domän i stort sett är oundgänglig.
Dystrofin kan bibehålla en stor grad av funktionalitet så länge som de väsentliga terminala domänerna är opåverkade, och exonhoppning sker endast inom den centrala stavdomänen. Med tanke på dessa parametrar kan exonhoppning användas för att återställa en öppen läsram genom att inducera en deletion av en eller flera exoner inom den centrala stavdomänen och därmed omvandla en DMD-fenotyp till en BMD-fenotyp.
Den genetiska mutationen som leder till Beckers muskeldystrofi är en in-frame deletion . Detta innebär att av de 79 exonerna som kodar för dystrofin kan en eller flera i mitten tas bort, utan att de exoner som följer efter deletionen påverkas. Detta möjliggör ett kortare dystrofinprotein än normalt som upprätthåller en viss funktionalitet. Vid Duchennes muskeldystrofi är den genetiska mutationen out-of-frame. Out-of-frame-mutationer orsakar ett för tidigt stopp i proteingenereringen - ribosomen kan inte "läsa" RNA förbi punkten för initialt fel - vilket leder till ett kraftigt förkortat och helt icke-funktionellt dystrofinprotein.
Målet med exon-hoppning är att manipulera splitsningsmönstret så att en mutation utanför ramen blir en mutation inom ramen, och därmed ändrar en allvarlig DMD-mutation till en mindre skadlig BMD-mutation inom ramen.
Ett exon-hoppande läkemedel godkändes 2016 av amerikanska FDA: eteplirsen (ExonDys51), en Morpholino -oligo från Sarepta Therapeutics inriktad på exon 51 av humant dystrofin. En annan exon-hoppande Morpholino, golodirsen (Vyondys 53) (inriktad på dystrofin exon 53), godkändes i USA i december 2019. En tredje antisensoligonukleotid , viltolarsen (Viltepso), riktad mot dystrofin exon 53 godkändes för medicinsk användning i USA stater i augusti 2020.
| läkemedel | exon | företag | UD FDA-godkännande |
|---|---|---|---|
| eteplirsen | 51 | Sarepta | september 2016 |
| golodirsen | 53 | Sarepta | december 2019 |
| viltolarsen | 53 | NS Pharma | augusti 2020 |
| casimerson | 45 | Sarepta | mars 2021 |
Genetisk testning, vanligtvis från blodprover, kan användas för att bestämma den exakta naturen och platsen för DMD-mutationen i dystrofingenen. Det är känt att dessa mutationer samlas i områden som kallas "hot spot"-regionerna - främst i exon 45–53 och i mindre utsträckning exon 2–20. Eftersom majoriteten av DMD-mutationer förekommer i dessa "hot spot"-regioner, kan en behandling som gör att dessa exoner hoppas över användas för att behandla upp till 50 % av DMD-patienterna.