Enkelmolekyl FRET

Single-molecule fluorescens (eller Förster) resonansenergiöverföring ( eller smFRET ) är en biofysisk teknik som används för att mäta avstånd på 1-10 nanometerskalan i enstaka molekyler , typiskt biomolekyler . Det är en tillämpning av FRET där ett par donator- och acceptorfluoroforer exciteras och detekteras på en enda molekylnivå. I motsats till "ensemble FRET" som tillhandahåller FRET-signalen för ett stort antal molekyler, kan en molekyl FRET lösa upp FRET-signalen för varje enskild molekyl. Variationen av smFRET-signalen är användbar för att avslöja kinetisk information som en ensemblemätning inte kan ge, särskilt när systemet är i jämvikt utan någon förändring av ensemble/bulksignal. Heterogenitet mellan olika molekyler kan också observeras. Denna metod har använts i många mätningar av intramolekylär dynamik såsom DNA/RNA/proteinveckning/uppveckning och andra konformationsförändringar, och intermolekylär dynamik såsom reaktion, bindning, adsorption och desorption som är särskilt användbara vid kemisk avkänning, bioanalyser och biosensing.

Metodik

Ett schema för ett typiskt smFRET-experiment (A), FRET-avståndskurva (B) och en tidsbana (C).

FRET-mätningar med en molekyl utförs vanligtvis på fluorescensmikroskop , antingen med ytimmobiliserade eller fritt spridande molekyler. Enstaka FRET-par belyses med intensiva ljuskällor, typiskt lasrar , för att generera tillräckliga fluorescenssignaler för att möjliggöra detektering av en enda molekyl. Wide-field multiphoton mikroskopi kombineras vanligtvis med total intern reflektion fluorescensmikroskop (TIRF) . Detta exciterar selektivt FRET-par på ytan av mätkammaren och avvisar brus från huvuddelen av provet. Alternativt konfokalmikroskopi minimerar bakgrunden genom att fokusera fluorescensljuset på ett nålhål för att avvisa ljus som inte är i fokus. Den konfokala volymen har en diameter på cirka 220 nm, och därför måste den skannas över om en bild av provet behövs. Med konfokal excitation är det möjligt att mäta mycket djupare in i provet än när man använder TIRF. Fluorescenssignalen detekteras antingen med ultrakänsliga CCD eller vetenskapliga CMOS-kameror för bredfältsmikroskopi eller SPAD :s för konfokalmikroskopi. När väl enstaka molekylintensiteter kontra tid är tillgängliga kan FRET-effektiviteten beräknas för varje FRET-par som en funktion av tiden och därigenom är det möjligt att följa kinetiska händelser på enkelmolekylskala och att bygga FRET-histogram som visar fördelningen av tillstånd i varje molekyl. Data från många FRET-par måste dock registreras och kombineras för att få allmän information om ett sampel eller en dynamisk struktur.

Ytimmobiliserad

I ytimmobiliserade experiment binds biomolekyler märkta med fluorescerande taggar till ytan av täckglaset och bilder av fluorescens förvärvas (vanligtvis av en CCD eller vetenskapliga CMOS -kameror). Datainsamling med kameror kommer att producera filmer av provet som måste bearbetas för att härleda en molekyls intensitet med tiden. Om ett konfokalmikroskop med en SPAD detektor används, molekylsökning görs först genom att skanna provet. Då sitter konfokalpunkten på en molekyl och samlar in intensitet-tidsdata direkt, vilket ger provdriften försumbar, eller så används en aktiv återkopplingsslinga för att hålla reda på molekylen.

En fördel med ytimmobiliserade experiment är att många molekyler kan observeras parallellt under en längre tid fram till fotoblekning (vanligtvis 1-30 s). Detta gör att vi enkelt kan studera övergångar som sker på långsamma tidsskalor. En nackdel representeras av de ytterligare biokemiska modifieringar som behövs för att länka molekyler till ytan och de störningar som ytan potentiellt kan utöva på den molekylära aktiviteten. Dessutom begränsas den maximala tidsupplösningen för intensiteter av en molekyl av kamerans insamlingstid (vanligtvis >1 ms).

Fritt spridande

SmFRET kan också användas för att studera konformationerna av molekyler som diffunderar fritt i ett vätskeprov. I fritt spridande smFRET-experiment (eller diffusionsbaserade smFRET) är samma biomolekyler fria att diffundera i lösning medan de exciteras av en liten excitationsvolym (vanligtvis en diffraktionsbegränsad fläck ). Utbrott av fotoner på grund av att en enda molekyl passerar excitationsfläcken förvärvas med SPAD detektorer. Den konfokala fläcken är vanligtvis fixerad i en given position (ingen skanning sker och ingen bild förvärvas). Istället registreras och ackumuleras de fluorescensfotoner som emitteras av enskilda molekyler som passerar excitationsvolymen för att bygga upp en fördelning av olika populationer som finns i provet. Beroende på komplexiteten i denna distribution varierar anskaffningstiden från ~5 minuter till flera timmar.

En utmärkande fördel med inställningar som använder SPAD-detektorer är att de inte begränsas av en "bildhastighet" eller en fast integrationstid som när man använder kameror. I själva verket, till skillnad från kameror, producerar SPADs en puls varje gång en foton detekteras, medan ytterligare elektronik behövs för att "tidsstämpla" varje puls med 10-50 ns upplösning. Den höga tidsupplösningen för konfokala enmolekylära FRET-mätningar tillåter observatörer att potentiellt upptäcka dynamik på tidsskalor så låga som 10 μs. Men att upptäcka "långsamma" övergångar på tidsskalor längre än diffusionstiden (vanligtvis ~ 1 ms) är svårare än i ytimmobiliserade experiment och kräver i allmänhet mycket längre förvärv.

Normalt detekteras den fluorescerande emissionen av både donator- och acceptorfluoroforer av två oberoende detektorer och FRET-signalen beräknas från förhållandet mellan intensiteter i de två kanalerna. Vissa uppsättningskonfigurationer delar ytterligare varje spektralkanal (donator eller acceptor) i två ortogonala polarisationer (därför kräver 4 detektorer) och kan mäta både FRET och fluorescensanisotropi samtidigt. I andra konfigurationer förvärvas 3 eller 4 spektrala kanaler samtidigt för att mäta flera FRET-par samtidigt. Både CW eller pulsade lasrar kan användas som excitationskällor. Vid användning av pulsade lasrar kan lämplig insamlingshårdvara mäta fotonens ankomsttid i förhållande till den sista laserpulsen med pikosekundupplösning, i den så kallade tidskorrelerade enkelfotonräkningen (TCSPC) förvärv. I denna konfiguration kännetecknas varje foton av en makrotid (dvs. en grov 10-50 ns tidsstämpel) och en mikrotid (dvs. fördröjning i förhållande till den sista laserpulsen). Den senare kan användas för att extrahera livstidsinformation och erhålla FRET-signalen.

Dataanalys

Typiska smFRET-data för ett tvåfärgssystem är tidsbanor för de fluorescerande emissionsintensiteterna för donatorfärgämnet och acceptorfärgämnet, som kallas de två kanalerna. I huvudsak används två metoder för att erhålla emissionen av de två färgämnena: (1) ackumulativ mätning använder en fast exponeringstid för kamerorna för varje bildruta, såsom PMT-, APD-, EMCCD- och CMOS-kamera; (2) ankommande tidssekvens för en foton mätt med PMT- eller APD-detektorer. Principen är att använda optiska filter eller dikroiska speglar för att separera emissionerna från de två färgämnena och mäta dem i två kanaler. Till exempel en uppställning med två halvor av en laddningskopplad enhet (CCD) kamera förklaras i litteraturen.

För ett system med två färgämnen används sedan emissionssignalerna för att beräkna FRET-effektiviteten mellan färgämnena över tiden. FRET-effektiviteten är antalet fotoner som emitteras från acceptorfärgämnet över summan av emissionerna från donatorn och acceptorfärgämnet. Tidsbanorna som produceras i varje experiment kan innehålla signaler från ofullständig eller felaktig märkning eller till och med aggregat. För att ta hänsyn till detta har flera forskargrupper utvecklat sofistikerade verktyg för val av tidsspår baserat på flera mätvärden, eller genom att använda djupa neurala nätverk. Vanligtvis är det bara donatorfärgämnet som exciteras, men ännu mer exakt information kan erhållas om donator- och acceptorfärgämnet omväxlande exciteras. I ett enda exciteringsschema är emissionen av donator- och acceptorfärgämnena bara antalet fotoner som samlats in för de två färgämnena dividerat med fotoninsamlingseffektiviteten för de två kanalerna, vilka är funktionerna för insamlingseffektiviteten, filtret och den optiska effektiviteten och kameraeffektiviteten för de två våglängdsbanden. Dessa effektivitetsgrader kan kalibreras för en given instrumentell uppställning.

FRET={\frac {\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}{{\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A }}}+{\tfrac {I_{D}}{\eta _{D}Q_{D}}}}}.

där FRET är FRET-effektiviteten för tvåfärgssystemet vid en tidsperiod, $I_{A}$ och $I_{D}$ är uppmätta fotonantal för acceptor- respektive donatorkanalen vid samma tidsperiod är $\eta _{A}$ och $\eta _{D}$ fotoninsamlingseffektiviteten för de två kanalerna, och $Q_{ A}$ och $Q_{D}$ är kvantutbytet av de två färgämnena. Således $I/\eta$ det faktiska antalet fotoner som emitteras från färgämnet. Om fotoninsamlingseffektiviteten för de två kanalerna är liknande och det faktiska FRET-avståndet inte är intresserad, kan man ställa in de två $\eta$ = 1, och de två kvantutbytena till 1 också.

(A) Ett exempel på tidsbanan för acceptor- (röd) och donator- (blå) kanalfotonräkningar samlade vid 1 ms tidsupplösning. (B) Data lagrades i 10 ms tidsupplösning för att minska bruset. Insättningen visar smFRET-tidsbanan beräknad med ekvationen. Den större fotoräkningsdelen har stort brus dominerat av räkningsberoende Gaussiskt brus och området för små fotoräkningar domineras av Poisson-bruset.

För ackumulerad emission smFRET-data innehåller tidsbanorna huvudsakligen följande information: (1) tillståndsövergångar, (2) brus, (3) kamerasuddare (analog av rörelseoskärpa), (4) fotoblinkning och fotoblekning av färgämnena. Tillståndsövergångsinformationen är den information som en typisk mätning vill ha. Men vilosignalerna stör dataanalysen och måste därför åtgärdas.

En lista över programvarupaket finns på KinSoftChallenge-webbplatsen. En rapport om jämförelseresultaten mellan dessa programvarupaket finns här.

Ljud

Brussignalen för färgämnesemissionen innehåller typiskt kameraavläsningsbrus, skottbrus och vitt brus , och verkligt provbrus, var och en följer en annan brusfördelning på grund av de olika källorna. Det verkliga bruset kommer från den termiska störningen av systemet som resulterar i FRET-avståndsbreddning, ojämn färgämnesorienteringsfördelning, färgämnesemissionsvariationer, snabb blinkning och kinetik som är snabbare än integrationstid. Långsamma variationer av färgämnesemissionen anses sannolikt vara falskt positiva tillstånd som experimentellt bör undvikas genom att välja olika färgämnen. De andra ljuden kommer från excitationsbanan och detekteringsbanan, speciellt kameran. I slutändan är bruset från de råa emissionsdata en kombination av ljud med Poissonfördelning och Gaussfördelning . Brusen i varje kanal kan ibland (t.ex. för singelfotondetektorer) förenklas till summeringen av ett intensitetsberoende Gaussiskt brus (ju högre antal desto större brus; det är en kombination av Gaussiskt och Poissonbrus med större amplitud som kan representeras av Gauss-funktionen) och ett Poisson-bakgrundsljud (oberoende av signalräkning). Det senare bruset dominerar när kanalen är i OFF eller lågintensivt läge (höger figur). Bruserna i de två kanalerna kombineras sedan till den icke-linjära ekvationen som anges ovan för att beräkna FRET-värdena. Därför är bruset på smFRET-banorna mycket komplicerat. Bruset är asymmetriskt över och under FRET-medelvärdena och dess storlek ändras mot de två ändarna (0 och 1) av FRET-värdena på grund av de ändrade osäkerheterna hos A- och D-kanalerna. De flesta brus kan reduceras genom att lagra data (se figur) med kostnaden för att förlora tidsupplösning. Se GitHub (postFRET) för ett exempel på MATLAB-koder för att simulera smFRET-tidsbanor utan och med brus (GitHub-länk ).

Kamerasuddighet

Kameraoskärpa simulerad med ett exempel på 3-tillstånds smFRET med hjälp av postFRET-simulatorn (två simuleringar). Signal-brusförhållandet är satt till cirka 20 för båda simuleringarna. Tidsupplösningen simuleras till 1 ms och lagras sedan till 10 ms, integrationstiden för de simulerade experimenten. Simuleringshastighetskonstanterna är listade till vänster, en liten del av banan visas i mitten (alternativa färger representerar olika molekyler), och FRET-histogrammet för alla molekyler (100) visas till höger.

Kamerans oskärpa signal kommer från den diskreta karaktären hos mätningarna. Emissionssignalen har en oöverensstämmelse med den verkliga övergångssignalen eftersom en eller båda är stokastiska (slumpmässiga). När en tillståndsövergång sker mellan avläsningen av två emissionsavläsningsintervall, är signalen medelvärdet av de två delarna i samma mätfönster, vilket sedan påverkar tillståndsidentifieringsnoggrannheten och så småningom hastighetskonstantanalysen. Detta är ett mindre problem när mätfrekvensen är mycket snabbare än övergångshastigheten men blir ett verkligt problem när de närmar sig varandra (figuren till höger). För att återspegla kamerasuddeffekten i de simulerade smFRET-banorna måste man simulera data i en högre tidsupplösning (t.ex. 10 gånger snabbare) än datainsamlingstiden och sedan lägga in data i de slutliga banorna. Se GitHub (postFRET) för ett exempel på MATLAB-koder för att simulera smFRET-tidsbanor med en snabbare tidsupplösning och lägg den sedan till mättidsupplösningen (integreringstiden) för att simulera kamerans suddighetseffekt.

Fotoblinkande och fotoblekning

Tidsbanorna innehåller också information om fotoblinkande och fotoblekning för de två färgämnena. Denna information måste tas bort, vilket skapar luckor i tidsbanan där FRET-informationen går förlorad. Informationen om fotoblinkning och fotoblekning kan tas bort för ett typiskt färgsystem med relativt långa fotoblinkningsintervall och fotoblekningslivslängder som har valts i mätningen. De är alltså ett mindre problem för dataanalys. Det kommer dock att bli ett stort problem om ett färgämne med korta blinkintervall eller lång livslängd i mörkt tillstånd används. Specifika kemiska lösningar har utvecklats för att mildra dessa två problem, såsom syreavlägsnande lösningar eller triplettstillståndssläckare.

Tillståndsidentifieringsalgoritmer

Flera dataanalysmetoder har utvecklats för att analysera data, såsom tröskelmetoder, Hidden Markov Model (HMM) metoder och metoder för identifiering av övergångspunkter. Tröskelmetoder sätter helt enkelt en tröskel mellan två angränsande tillstånd på smFRET-banorna. FRET-värdena över tröskeln tillhör ett tillstånd och värdena under tillhör ett annat. Denna metod fungerar för data med ett mycket högt signal-brusförhållande och har således urskiljbara FRET-tillstånd. Denna metod är intuitiv och har en lång historia av applikationer. Ett exempel på källkod finns i programvaran postFRET. HMM är baserade på algoritmer som statistiskt beräknar sannolikhetsfunktioner för varje tillståndstilldelning, dvs lägger till straff till en mindre sannolik tilldelning. De typiska mjukvarupaketen med öppen källkod kan hittas online som HaMMy, vbFRET, ebFRET, SMART, SMACKS, MASH-FRET, etc. Transition-point analysis eller change-point analysis (CPA) använder algoritmer för att identifiera när en övergång sker över tidsbanan med hjälp av statistisk analys. Till exempel CPA baserat på Fisher informationsteori och studentens t-testmetod (STaSI, öppen källkod, GitHub-länk) identifierar tillståndsövergångar och minimerar beskrivningslängden genom att välja det optimala antalet tillstånd, dvs balansera straffvärdet för brus och det totala antalet tillstånd.

Betygsanalys

När väl tillstånden har identifierats kan de användas för att beräkna Förster-resonansenergiöverföringsavstånden och övergångshastighetskonstanter mellan tillstånden. För en parallell reaktionsmatris bland tillstånden kan hastighetskonstanterna för varje övergång inte dras ut från medellivslängderna för varje övergång, som är fixerad som den inversa summan av hastighetskonstanterna. Livstiderna för övergångar från ett tillstånd till alla andra tillstånd är alla "samma" för en enda molekyl. Hastighetskonstanterna kan dock beräknas från sannolikhetsfunktionerna, antalet för varje övergång under den totala tiden för tillståndet den överförs från.

k_{if}={\frac {N_{if}}{\sum _{f=1}^ {f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}

Ett exempeltillstånd identifierade bana och uppehållstidshistogrammet för varje övergång. Livstid är medelvärdet av alla uppehållstider, vilket är inversen av summan av alla hastighetskonstanter för tillståndet till andra tillstånd.

där i är det initiala tillståndet, f är det slutliga tillståndet för övergången, N är antalet av dessa övergångar i tidsbanorna, n är det totala antalet tillstånd, k är hastighetskonstanten, t är tiden för varje tillstånd före övergången sker. Till exempel mäter man 130 sekunder (s) av smFRET-tidsbanor. Den totala tiden för en molekyl stannar i tillstånd ett är t ₁ = 100 sekunder (s), tillstånd två t ₂ = 20 s, och tillstånd tre är t ₃ = 10 s. Bland de 100 s som molekylen förblir tillstånd ett, den övergår till tillstånd två 70 gånger och övergår till tillstånd tre 30 gånger vid slutet av sina uppehållstider, hastighetskonstanten för tillstånd 1 till tillstånd 2 är alltså k 12 = _70/100 = 0,7 s ⁻¹ , hastighetskonstanten för tillstånd 1 till tillstånd 3 är k ₁₃ = 30/100 = 0,3 s ⁻¹ . Vanligtvis är sannolikheterna för längderna av 70 gånger eller 30 gånger övergången (uppehållstider) exponentiellt fördelade (höger figur). De genomsnittliga uppehållstiderna för de två fördelningarna av tillstånd ett, dvs de två livstiderna, τ ₁₂ och τ ₁₃ , är båda desamma vid 1 s för dessa två övergångar (höger figur). Antalet övergångar N kan vara det totala antalet tillståndsövergångar eller den anpassade amplituden för den exponentiella avklingningsfunktionen för det ackumulerade histogrammet för tillståndsuppehållstiderna. Det senare fungerar bara för väluppfostrade uppehållstidsfördelningar. Ett system i jämvikt med varje tillstånd parallella överföringar till alla andra i första ordningens reaktioner är ett specialfall för lättare förståelse. När systemet inte är i jämvikt, gäller denna ekvation fortfarande, men man bör vara försiktig med att använda den.

Tolkningen av ovanstående ekvation är helt enkelt baserad på antagandet att varje molekyl är densamma, den ergodiska hypotesen . Existensen av varje stat representeras bara av dess totala tid som är dess "koncentration". Således är övergångshastigheten till vilket annat tillstånd som helst antalet övergångar normaliserade av denna koncentration. Numeriskt kan tidskoncentrationen omvandlas till talkoncentration för att efterlikna en ensemblemätning. Eftersom de enskilda molekylerna är desamma som alla andra molekyler, kan vi anta att tidsbanan är en slumpmässig kombination av många molekyler som var och en bara upptar en mycket kort tidsperiod, säg 𝛿 t . Således är "koncentrationen" av molekylen vid tillstånd n c _n = t _n / 𝛿 t . Bland alla dessa "molekyler", om N _nf överförs till tillstånd f under denna mättid 𝛿 t , är överföringshastigheten per definition r = N _nf / 𝛿 t = k _nf c _n . Således k _nf = N _nf / t _n .

Man kan se att den enstaka molekylmätningen av hastighetskonstanten endast är beroende av den ergodiska hypotesen, som kan bedömas om ett statistiskt tillräckligt antal enstaka molekyler mäts och förväntade väluppfostrade fördelningar av uppehållstider observeras. Heterogenitet bland enstaka molekyler kan också observeras om varje molekyl har en urskiljbar uppsättning tillstånd eller uppsättning hastighetskonstanter.

Minska osäkerhetsnivån

Osäkerhetsnivån för frekvensanalysen kan uppskattas från flera experimentella försök, bootstrapping- analys och anpassningsfelanalys. Tillståndsfeltilldelning är en vanlig felkälla under dataanalysen, som härrör från tillståndsbreddning, brus och kamerasuddighet. Databinning , glidande medelvärde och wavelet-transformering kan hjälpa till att minska effekten av tillståndsbreddning och brus, men kommer att förstärka kamerans suddighetseffekt.

Kamerans suddighetseffekt kan reduceras via snabbare samplingsfrekvens beroende på utvecklingen av en känsligare kamera, speciell dataanalys eller både och. Traditionellt i HMM är datapunkten före och efter övergången speciellt tilldelad för att reducera fel tilldelningshastighet för dessa datapunkter till tillstånd mellan övergången. Det finns dock en begränsning för att denna metod ska fungera. När övergångsfrekvensen närmar sig samplingsfrekvensen är för mycket data suddiga för att den här metoden ska fungera (se bilden ovan för kameraskärpan). Ett experimentellt tillvägagångssätt med användning av en pulsad laser har rapporterats för att delvis övervinna kamerasuddeffekten utan en mycket snabb kamera. Tanken är att endast belysa en mycket kort period i varje kamerauppsamlingscykel för att undvika medelvärdesbildning av signalen i varje cykel.

En tvåstegs dataanalysmetod har också rapporterats för att öka analysnoggrannheten för kamerasuddig data. Tanken är att simulera en bana med Monte Carlo-simuleringsmetoden och jämföra den med experimentdata. Vid rätt tillstånd kommer både simuleringen och experimentdata att innehålla samma grad av suddighetsinformation och brus. Denna simulerade bana är ett bättre svar än den råa experimentella data eftersom dess grundsanning är "känd". Denna metod har öppen källkod tillgängliga som postFRET (GitHub-länk ) och MASH-FRET. Denna metod kan också något korrigera effekten av det icke-Gaussiska bruset som har orsakat problem att exakt identifiera tillstånden med de statistiska metoderna.

Den nuvarande dataanalysen för smFRET kräver fortfarande stor omsorg och särskild utbildning, vilket kräver att algoritmer för djupinlärning spelar en roll för att frigöra arbetskraften vid dataanalys.

Fördelar

Jämför schematiska resultat av bulk (orange), ensemble FRET (svart) och smFRET mätning av ett system med tre tillstånd (1-3). Bulkmätning lägger till alla tillstånd och smFRET löser var och en genom att räkna populationen av molekyler i varje tillstånd över tiden. Den kinetiska informationen är dold i bulk- och ensemblemätningen men kan observeras i smFRET-mätningen genom att analysera övergångarna mellan varje tillstånd över tiden.

SmFRET möjliggör en mer exakt analys av heterogena populationer och har några fördelar jämfört med ensemble FRET.

En fördel med att studera avstånd i enstaka molekyler är att heterogena populationer kan studeras mer exakt med värden specifika för varje molekyl snarare än att beräkna ett genomsnitt baserat på en ensemble. Detta möjliggör studier av specifika homogena populationer inom en heterogen population. Till exempel, om två existerande homologa populationer inom en heterogen population har olika FRET-värden, kommer en ensemble FRET-analys att producera ett vägt genomsnittligt FRET-värde för att representera populationen som helhet. Således producerar det erhållna FRET-värdet inte data om de två distinkta populationerna. Däremot skulle smFRET kunna skilja mellan de två populationerna och skulle möjliggöra en analys av de befintliga homologa populationerna.

SmFRET ger också dynamisk tidsupplösning av en enskild molekyl som inte kan uppnås genom ensemble FRET-mätningar. Ensemble FRET har förmågan att upptäcka välbefolkade övergångstillstånd som ackumuleras i en population, men den saknar förmågan att karakterisera intermediärer som är kortlivade och inte ackumuleras. Denna gräns åtgärdas av smFRET som erbjuder ett direkt sätt att observera intermediärer av enskilda molekyler oavsett ackumulering. När du observerar en tillräckligt lång tid på en molekyl kommer det att inträffa händelser i övergångstillståndet som varar tillräckligt länge för att skilja det från brus eller breddningen av andra tillstånd. Därför visar smFRET förmågan att fånga övergående subpopulationer i en heterogen miljö.

Kinetisk information i ett system under jämvikt går förlorad på ensemblenivå eftersom ingen av koncentrationerna av reaktanterna och produkterna förändras över tiden. På enkelmolekylnivå kan emellertid överföringen mellan reaktanterna och produkterna ske i en mätbar hög hastighet och balanseras över tiden stokastiskt. Således möjliggör spårning av tidsbanan för en viss molekyl direkt mätning av hastighetskonstanten för varje övergångssteg, inklusive de mellanprodukter som är dolda på ensemblenivå på grund av deras låga koncentrationer. Detta gör att smFRET kan användas för att studera DNA , RNA och protein s vikningsdynamik. I likhet med proteinveckning går DNA- och RNA-veckning igenom flera interaktioner, veckningsvägar och mellanprodukter innan de når sina ursprungliga tillstånd.

SmFRET har också visat sig använda ett trefärgssystem bättre än ensemble FRET. Genom att använda två acceptorfluoroforer snarare än en, kan FRET observera flera platser för korrelerade rörelser och rumsliga förändringar i vilken komplex molekyl som helst. Detta visar forskningen om Holliday Junction . SmFRET med trefärgssystemet ger insikter i synkroniserade rörelser av korsningens tre spiralformade platser och nästan obefintlig av dess parallella tillstånd. Ensemble FRET kan också använda ett trefärgssystem. Alla uppenbara fördelar uppvägs dock av trefärgssystemets krav som inkluderar en tydlig separation av fluoroforsignaler. För en tydlig distinktion av signal måste FRET-överlappningar vara små men det försvagar också FRET-styrkan. SmFRET korrigerar sina överlappningsbegränsningar genom att använda bandpassfilter och dikroiska speglar som främjar signalen mellan två fluorescensacceptorer och löser eventuella genomströmningseffekter.

Ansökningar

En viktig tillämpning av smFRET är att analysera de små biokemiska nyanserna som underlättar proteinveckning . Under de senaste åren har flera tekniker utvecklats för att undersöka singelmolekylinteraktioner som är involverade i proteinveckning och -veckning. Force-probe-tekniker , med hjälp av atomkraftsmikroskopi och laserpincett , har gett information om proteinstabilitet. smFRET tillåter forskare att undersöka molekylära interaktioner med hjälp av fluorescens. Forster resonansenergiöverföring (FRET) applicerades först på enstaka molekyler av Ha et al. och appliceras på proteinveckning i arbete av Hochstrasser, Weiss, et al. Fördelen som smFRET som helhet har gett för att analysera molekylära interaktioner är förmågan att testa enstaka molekylinteraktioner direkt utan att behöva genomsnittliga ensembler av data. I proteinveckningsanalys involverar ensembleexperiment att ta mätningar av flera proteiner som befinner sig i olika tillstånd av övergång mellan sitt vikta och ovikta tillstånd . När medelvärdet beräknas ger proteinstrukturen som kan härledas från dataensemblen endast en rudimentär strukturell modell för proteinveckning. Emellertid kräver en sann förståelse av proteinveckning att dechiffrera sekvensen av strukturella händelser längs veckningsvägarna mellan de vikta och ovikta tillstånden. Det är just den här forskningsgrenen som smFRET är mycket användbar.

FRET-studier beräknar motsvarande FRET-effektivitet som ett resultat av tidsupplöst observation av proteinveckningshändelser . Dessa FRET-effektiviteter kan sedan användas för att sluta sig till avstånd mellan molekyler som en funktion av tiden. När proteinet övergår mellan de vikta och ovikta tillstånden, kan motsvarande avstånd mellan molekyler indikera sekvensen av molekylära interaktioner som leder till proteinveckning.

En annan tillämpning av smFRET är för DNA- och RNA-veckningsdynamik. Typiskt är två olika platser för en nukleotid märkta med donator- och acceptorfärgämnen. Förändringen av avståndet mellan de två platserna förändras över tiden på grund av nukleotidens vikning och utveckning plus den slumpmässiga diffusionen av de två punkterna över tiden, inom varje mätfönster och mellan olika fönster. På grund av komplexiteten i viknings-/utvikningsbanan är det extremt svårt att mäta processen på ensemblenivå. Således blir smFRET en nyckelteknik inom detta område. Utöver utmaningarna med smFRET-dataanalys är en utmaning att märka flera positioner av intresse, en annan är från tvåpunktsdynamiken för att beräkna de övergripande vikningsvägarna.

Enkelmolekyl FRET kan också användas för att studera konformationsförändringarna av de relevanta kanalmotiven i vissa kanaler . Till exempel märktes märkta tetramera KirBac-kaliumkanaler med donator- och acceptorfluoroforer på särskilda ställen för att förstå den strukturella dynamiken inom lipidmembranet, vilket gör det möjligt för dem att generalisera liknande dynamik för liknande motiv i andra eukaryota Kir-kanaler eller till och med katjon kanaler i allmänhet. Användningen av smFRET i detta experiment möjliggör visualisering av konformationsförändringarna som inte kan ses om de makroskopiska mätningarna helt enkelt beräknas. Detta kommer att leda till ensembleanalys snarare än analys av enskilda molekyler och konformationsförändringarna inom, vilket gör att vi kan generalisera liknande dynamik för liknande motiv i andra eukaryota kanaler.

KirBac-kanalens strukturella dynamik har analyserats grundligt i både öppna och slutna tillstånd, beroende på närvaron av liganden PIP2 . En del av resultaten baserade på smFRET visade den extracellulära regionens strukturella stelhet. Selektivitetsfiltret och den yttre slingan av selektivitetsfilterregionen märktes med fluoroforer och konformationskoppling observerades. De individuella smFRET-banorna visade starkt en FRET-effektivitet på cirka 0,8 utan fluktuationer, oavsett kanalens tillstånd.

Nyligen har enkelmolekyl FRET använts för att kvantitativt detektera mål-DNA och för att särskilja enkelnukleotidpolymorfism. Till skillnad från ensemble FRET tillåter enkelmolekyl FRET realtidsövervakning av målbindningshändelser. Dessutom leder den låga bakgrunden och det höga signal-brusförhållandet som observerats med FRET-tekniken med en molekyl till ultrakänslighet (detektionsgräns i femtomolarområdet). Nuförtiden är olika typer av signalförstärkningssteg införlivade för att trycka ner detektionsgränsen.

Begränsningar

Trots att man gör ungefärliga uppskattningar är en begränsning av smFRET svårigheten att få rätt avstånd involverat i energiöverföring. Att kräva en korrekt avståndsuppskattning ger upphov till en stor utmaning eftersom fluorescensen hos donator- och acceptorfluoroforerna, såväl som energiöverföringen, är beroende av miljön och hur färgämnena är orienterade, vilket kan variera beroende på flexibiliteten hos var fluoroforer är bundna. Dessutom kan det faktiska avståndet för ett givet tillstånd vara dynamiskt och det uppmätta värdet representerar det genomsnittliga avståndet inom insamlingstidsramen. Denna fråga är emellertid inte särskilt relevant när avståndsuppskattningen av de två fluoroforerna inte behöver bestämmas med exakt och absolut precision.

Att extrahera kinetisk information från ett komplicerat biologiskt system med en övergångshastighet på runt några millisekunder eller lägre är fortfarande utmanande. De aktuella tidsupplösningarna för sådana mätningar är vanligtvis på millisekundsnivån med några få rapporter på mikrosekundsnivån. Det finns en teoretisk begränsning för färgfotofysik. Livslängden för det exciterade tillståndet för en typisk organisk färgämnesmolekyl är cirka 1 nanosekund. För att erhålla statistisk konfidens för FRET-värdena krävs tiotals till hundratals fotoner, vilket ger bästa möjliga tidsupplösning i storleksordningen 1 mikrosekund. För att nå denna gräns krävs mycket starkt ljus (effekttäthet i storleksordningen 1×10 ¹⁰ W m ⁻² , 10 ⁷ sol som vanligtvis uppnås genom att fokusera en laserstråle med hjälp av ett mikroskop), vilket ofta orsakar fotoskador på de organiska molekylerna. En annan begränsning är färgämnets fotoblekningslivslängd, som är en funktion av ljusintensiteten och oxidations-/reduktionsstressen i miljön. Livslängden för fotoblekning av ett typiskt organiskt färgämne under typiska experimentella förhållanden (laserkrafttäthet bara några få solar) är på några sekunder, eller några minuter med hjälp av syreavlägsnande lösningar. Således är kinetiska händelser längre än några minuter svåra att undersöka med organiska färgämnen. Andra prober med längre livslängder såsom kvantprickar, polymerprickar och helt oorganiska färgämnen måste användas istället för de organiska färgämnena.

externa länkar