Bredfälts multifotonmikroskopi

Avbildningssystem som visar ett bredfälts multifotonmikroskop

Wide-field multiphoton mikroskopi hänvisar till en optisk icke-linjär avbildningsteknik skräddarsydd för ultrasnabb avbildning där ett stort område av objektet belyses och avbildas utan behov av skanning. Höga intensiteter krävs för att inducera icke-linjära optiska processer såsom två-fotonfluorescens eller generering av andra övertoner . Vid skanning av multifotonmikroskop uppnås de höga intensiteterna genom att fokusera ljuset tätt, och bilden erhålls genom strålskanning. I bredfälts multifotonmikroskopi uppnås de höga intensiteterna bäst med en optiskt förstärkt pulsad laserkälla för att uppnå ett stort synfält (~100 µm). Bilden i detta fall erhålls som en enda bildruta med en CCD utan behov av skanning, vilket gör tekniken särskilt användbar för att visualisera dynamiska processer samtidigt över föremålet av intresse. Med bredfälts multifotonmikroskopi kan bildhastigheten ökas upp till 1000 gånger jämfört med multifotonskanningsmikroskopi . Bredfälts multifotonmikroskop är ännu inte kommersiellt tillgängliga, men fungerande prototyper finns i flera optiska laboratorier.

Introduktion

Det huvudsakliga kännetecknet för tekniken är belysningen av ett brett område på provet med en pulsad laserstråle. I olinjär optik är mängden olinjära fotoner (N) som genereras av en pulsad stråle per (belysande) area per sekund proportionell mot

$N\varpropto {\frac {E^{2}}{\tau A}}f$ ,

där E är strålens energi i joule, τ är pulsens varaktighet i sekunder, A är den lysande arean i kvadratmeter och f är repetitionshastigheten för den pulsade strålen i Hertz. En ökning av belysningsarean minskar således mängden genererade olinjära fotoner om inte energin ökas. Optisk skada beror på energitätheten, dvs toppintensitet per area I _p =E/(τA). Därför kan både arean och energin enkelt ökas utan risk för optisk skada om toppintensiteten per area hålls låg, och ändå kan en vinst i mängden genererade olinjära fotoner erhållas på grund av det kvadratiska beroendet. Till exempel att öka både arean och energin 1000 gånger, lämnar toppintensiteten oförändrad men ökar de genererade olinjära fotonerna med 1000 gånger. Dessa 1000 extra fotoner genereras verkligen över ett större område. Vid bildbehandling innebär detta att de extra 1000 fotonerna sprids över bilden, vilket till en början kanske inte verkar vara en fördel jämfört med multifotonskanningsmikroskopi. Fördelen blir dock uppenbar när bildens storlek och skanningstiden beaktas. Mängden olinjära fotoner per bildruta per sekund som genereras av ett bredfälts multifotonmikroskop jämfört med ett skanningsmultifotonmikroskop ges av

${\frac {N_ {\mathrm {wide-field} }}{N_{\mathrm {scanning} }}}=n{\frac {f_{\mathrm {wide-field} }}{f_{\mathrm {scanning} }}}$ ,

när man antar att samma toppintensitet används i båda systemen. Här är n antalet skanningspunkter så att ${\textstyle A_{\mathrm {wide-field} }=nA_{\mathrm {skanning} }}$ .

Begränsningar

Tekniken är inte lämplig för avbildning djupt i spridningsvävnad (t.ex. hjärna), eftersom bildkvaliteten snabbt försämras med ökande djup
Gränsen till vilken energin kan ökas beror på lasersystemet. Optiska förstärkare, såsom en regenerativ förstärkare , kan typiskt ge energier på upp till mJ med lägre repetitionshastigheter jämfört med oscillatorbaserade system (t.ex. Ti:safirlaser) .
Möjlig skada på optiken om strålen fokuseras på något sätt någonstans i det optiska systemet till ett litet område. Det finns olika metoder för att uppnå önskad belysning utan risk för att skada optiken (se Metoder).
Djuptvärsnitt kan saknas.

Fördelar

Ultrasnabb bildbehandling. En enda laserbild behövs för att producera en bild. Bildhastigheten är således begränsad till lasersystemets repetitionshastighet eller CCD-kamerans bildhastighet.
Lägre skada i celler. I vattenhaltiga system (såsom celler) tillåter medel till låga repetitionshastigheter (1 – 200 kHz) att termisk diffusion uppstår mellan belysningspulser så att skadetröskeln är högre än med höga repetitionsfrekvenser (80 MHz).
Hela objektet kan observeras samtidigt på grund av den breda belysningen.
Större penetrationsdjup i biologisk avbildning jämfört med en-fotonfluorescens på grund av de längre våglängder som krävs.
Högre upplösning än bredfälts enfotonfluorescensmikroskopi. Den optiska upplösningen kan vara jämförbar eller bättre än multifoton scanning mikroskop [].

Metoder

Det finns den tekniska svårigheten att uppnå ett stort belysningsområde utan att förstöra bildoptiken. Ett tillvägagångssätt är den så kallade spatiotemporala fokuseringen i vilken den pulsade strålen sprids rumsligt av ett diffraktionsgitter som bildar en "regnbågs"-stråle som därefter fokuseras av en objektivlins. Effekten av att fokusera "regnbågs"-strålen samtidigt som diffraktionsgittret avbildas tvingar de olika våglängderna att överlappa vid objektivlinsens fokalplan. De olika våglängderna stör då endast vid den överlappande volymen, om ingen ytterligare rumslig eller tidsmässig dispersion införs, så att den intensiva pulsade belysningen hämtas och kan ge bilder i tvärsnitt. Den axiella upplösningen är vanligtvis 2-3 µm även med strukturerad belysningsteknik. Den rumsliga spridningen som genereras av diffraktionsgittret säkerställer att energin i lasern sprids över ett bredare område i objektivlinsen, vilket minskar risken för att skada själva linsen.

Till skillnad från vad man från början trodde, är tidsfokusering anmärkningsvärt robust mot spridning. Dess förmåga att penetrera genom grumliga medier med minimal fläck användes inom optogenetik , vilket möjliggör fotoexcitering av godtyckliga ljusmönster genom vävnad. Temporal fokusering kombinerades senare med enpixeldetektion för att övervinna effekten av spridning på fluorescerande fotoner. Denna teknik, kallad TRAFIX, möjliggjorde bredfältsavbildning genom biologisk vävnad på stora djup med högre signal-till-bakgrundsförhållande och lägre fotoblekning än standard punktskannande tvåfotonmikroskopi .

En annan enklare metod består av två strålar som är löst fokuserade och överlappade på ett område (~100 µm) på provet. Med denna metod är det möjligt att få tillgång till alla element i ${\displaystyle \chi ^{(2)}}-$ tensorn tack vare möjligheten att kunna ändra polariseringen för varje stråle oberoende av varandra.