Differentialextraktion

Differentiell extraktion (även känd som differentiell lysis) hänvisar till den process genom vilken DNA från två olika typer av celler kan extraheras utan att blanda deras innehåll. Den vanligaste tillämpningen av denna metod är extraktion av DNA från vaginala epitelceller och spermier från sexuella övergrepp för att fastställa offrets och gärningsmannens DNA-profiler . Dess framgång bygger på det faktum att spermieceller packar sitt DNA med hjälp av protaminer (snarare än histoner) som hålls samman av disulfidbindningar. Protaminerna binder DNA från spermier, vilket gör det mer motståndskraftigt mot DNA-extraktion än DNA från epitelceller.

Efter att ha fastställt att spermieceller finns närvarande (vanligtvis genom färgning och ljusmikroskopi) i ett vaginalt/rektalt prov, lyseras patientens epitelceller med en standard DNA-extraktionsmetod, som en fenol/kloroformextraktion och deras DNA extraheras på normalt sätt . Epitelial-DNA i lösning tas bort och sparas, medan spermiecellens DNA fälls ut med de vidhäftade protaminerna. Differentialextraktion använder en kemikalie som kallas ditiotreitol (DTT) för att störa svavelbindningarna i protaminerna för att frigöra dess DNA. När DNA:t har lösgjorts från protaminerna är det benäget att använda standardmetoder för DNA-extraktion. Detta skapar två olika DNA-fraktioner från ett prov, offrets och gärningsmannens.

Den beskrivna metoden är dock svår att genomföra eftersom den är både mycket arbetskrävande och tidskrävande, vilket leder till en uppbyggnad av oprövade våldtäktssatser. Enbart uppskattningsvis 500 000 våldtäktspaket i USA. Greenspoon et al. rapporterade förbättringar i provbehandlingseffektivitet och genomströmning med hjälp av robotautomation. Däremot kan associerade kostnader för implementering i samband med lågkapacitetsmängder av prover vara opraktiska för kriminaltekniska laboratorier och kan inte motiveras.

introducerades ett flerstegs nukleinsyraextraktionsförfarande för att tillhandahålla DNA-lysat av högsta kvalitet. Ett självtätande membran möjliggör en stegvis frisättning och separation av DNA från blandade prover. Implementerad i ett spin-kolumnsystem , är det idealiskt lämpligt för DNA-extraktionsprocedurer som involverar differentiell extraktion av rättsmedicinska prover som epitel, saliv eller blod kontra spermier. Enkla och tillförlitliga extraktionsprotokoll för både färgade prover och gynekologiska pinnprover övervinner de ofta hävdade svårigheterna med differentiell extraktion (t.ex. att förlora en spermiepellet genom flera tvättsteg).

Vidare är ett tidigt kvalificerat beslut om huruvida processen med ett differentiellt uttag är värt tiden och ansträngningarna möjlig på grund av gradvis buffertseparering. Som ett immunologiskt förtest för sperma i ett prov av sexuella övergrepp kan utföras med samma prov.

Arbetsflöde

Arbetsflöde för differentiell lysering av ett prov av bevis för sexuella övergrepp visas. Alla steg i den stegvisa DNA-extraktionsprocessen beskrivs i detalj.

Först och främst kan humana proteiner, t.ex. humant semenogelinantigen, valfritt isoleras och analyseras immunologiskt för att snabbt kontrollera förekomsten av human sädesvätska. Om detta test visar ett positivt resultat kommer samma ärendeprov att behandlas vidare. Den första delen av den differentiella lysen utförs under milda förhållanden för att få kvinnligt DNA. Lysat av epitelcellerna hålls kvar i kolonnen även under värmeinkubation och måttlig skakning. Vid centrifugering passerar lösningen kolonnen in i uppsamlingsröret. DNA-lysatet renas ytterligare och används för att generera en autosomal STR-profil för offret. För att ytterligare erhålla det manliga DNA som kommer att identifiera gärningsmannen, kommer hårdare lysförhållanden att tillämpas efteråt på samma filterkolonn utan att provtransporten behövs för att bryta upp de kvarhållna spermierna. På grund av det höga utbytet av DNA ökar chansen avsevärt för en framgångsrik DNA-profil genom nedströmsanalys. Denna enkla hantering möjliggör tidsbesparingar och högre genomströmning i denna manuella process för att förbättra frekvensen av brottslösningar och för att påskynda analysen av eftersatta brottsprover.