Dideoxinukleotid
Dideoxinukleotider är kedjeförlängande hämmare av DNA-polymeras , som används i Sanger-metoden för DNA-sekvensering . De är också kända som 2',3' eftersom både 2'- och 3'-positionerna på ribosen saknar hydroxylgrupper och förkortas som ddNTPs (ddGTP, ddATP, ddTTP och ddCTP).
Roll i Sangermetoden
Sanger-metoden används för att amplifiera ett målsegment av DNA, så att DNA-sekvensen kan bestämmas exakt. Inkorporeringen av ddNTP i reaktionsventilerna används helt enkelt för att avsluta syntesen av en växande DNA-sträng, vilket resulterar i delvis replikerade DNA-fragment. Detta beror på att DNA-polymeras kräver 3' OH-gruppen i den växande kedjan och 5'-fosfatgruppen i den inkommande dNTP för att skapa en fosfodiesterbindning . Ibland kommer DNA-polymeraset att inkorporera en ddNTP och frånvaron av 3'-OH-gruppen kommer att avbryta kondensationsreaktionen mellan 5'-fosfatet (efter klyvningen av pyrofospat ) av den inkommande nukleotiden med 3'-hydroxylgruppen i den föregående nukleotiden på växande sträng. Denna kondensationsreaktion skulle normalt inträffa med inkorporering av en icke-modifierad dNTP av DNA-polymeras. I det enklaste av termer leder den nukleofila attacken av 3' OH-gruppen till tillsatsen av en nukleotid till en växande kedja. Frånvaron av 3'-hydroxylgruppen hämmar denna nukleofila attack från att inträffa, vilket inaktiverar DNA-polymerasets förmåga att fortsätta med sin funktion.
Denna upptäckt ledde till dess passande namn "Kedjeavslutande nukleotider". Dideoxiribonukleotiderna har ingen 3'-hydroxylgrupp, varför ingen ytterligare kedjeförlängning kan ske när denna dideoxinukleotid väl finns på kedjan. Detta kan leda till att DNA-sekvensen avbryts. Således utgör dessa molekyler grunden för dideoxikedjetermineringsmetoden för DNA-sekvensering , som rapporterades av Frederick Sanger och hans team 1977 som en förlängning av tidigare arbete. Sangers tillvägagångssätt beskrevs 2001 som en av de två grundläggande metoderna för att sekvensera DNA-fragment (den andra är Maxam–Gilbert-metoden ) men Sanger-metoden är både den "mest använda och den metod som används av de flesta automatiserade DNA-sekvenserare." Sanger vann sitt andra Nobelpris i kemi 1980, och delade det med Walter Gilbert ("för deras bidrag rörande bestämning av bassekvenser i nukleinsyror") och med Paul Berg (" för hans grundläggande studier av nukleinsyrors biokemi, med särskilt avseende rekombinant-DNA "), och diskuterade användningen av dideoxinukleotider i sin Nobelföreläsning.
DNA-sekvensering
Dideoxinukleotider är användbara vid sekvensering av DNA i kombination med elektrofores . Ett DNA-prov som genomgår PCR ( polymeraskedjereaktion ) i en blandning som innehåller alla fyra deoxinukleotiderna och en dideoxinukleotid kommer att producera strängar med längd lika med positionen för varje bas av typen som kompletterar typen med en dideoxinukleotid närvarande. Taq -polymeraset som används i PCR gynnar ddGNTP, som har varit ett mönster som observerats i olika forskning. Det vill säga att varje nukleotidbas av den specifika typen har en sannolikhet att vara bunden till inte en deoxinukleotid utan snarare en dideoxinukleotid, som avslutar kedjeförlängning. Därför, om provet sedan genomgår elektrofores, kommer det att finnas ett band närvarande för varje längd vid vilken komplementet av dideoxinukleotiden är närvarande. Det är nu vanligt att använda fluorescerande dideoxinukleotider så att var och en av de fyra har olika fluorescens som kan detekteras av en sekvenserare; därför behövs bara en reaktion.
Produktion
I en patenterad metod användes tetrahydrofuran i ett lösningsmedel innehållande 50 g (0,205 mol) uridin (eller, förmodligen, vilken oskyddad nukleosid som helst ), 112 ml (1,03 mol) metylortoformiat och 10 g (52,6 mmol) paratoluensulfonsyra vid rumstemperatur under omrörning. Efter omrörning vid rumstemperatur under 24 timmar hälldes reaktionsblandningen i en vattenhaltig natriumbikarbonatlösning följt av extraktion med kloroform 5 gånger. Extraktet torkades över natriumsulfat och koncentrerades för att ge 49,5 g (0,173 mol) 2',3'-o-metoximetylideneuridin (utbyte 84,5%). Efter denna reaktion löses sedan uridinexempelprodukten 2',3'-o-metoximetylideneuridin i 50 ml ättiksyraanhydrid vid rumstemperatur under omröring. Lösningen upphettades till 140°C och hölls vid denna temperatur i 5 timmar under återflöde av lösningsmedlet. Efter kylning till rumstemperatur avlägsnades lösningsmedlet genom destillation under reducerat tryck, 50 ml vatten tillsattes och blandningen extraherades 3 gånger med 100 ml kloroform. Extraktet koncentrerades under reducerat tryck, 30% ammoniakvatten för att erhålla ett 82,3% utbyte av 2',3'-dideoxi-2',3'-didehydrouridin. Detta produktexempel hydratiseras sedan för att avlägsna dubbelbindningen genom att lösa den i metanol (10 ml) innehållande en katalysator (våt 5% palladium på kol) (400 mg) i en atmosfär av väte under 1 timme för att erhålla den resulterande dideoxinukleosiden (2) ',3'-dideoxiuridin i detta fall). Den färgämnesnukleotid som ska användas kommer sannolikt att inträffa genom behandling med ett fosforyleringsenzym och biotinylering och reaktion av den biotinylerade substansen med färgämnet . Det är möjligt att omedelbar reaktion med färgämnet också kan inträffa, men att förlänga armen påstås öka effektiviteten vid användning av en mutant form av DNA-polymeras
externa länkar
-
Media relaterade till Dideoxinukleotider på Wikimedia Commons
