Deterministisk streckkodning i vävnad för Spatial Omics-sekvensering

Deterministic Barcoding in Tissue for Spatial Omics Sequencing ( DBiT-seq ) utvecklades vid Yale University av Rong Fan och kollegor 2020 för att skapa en multiomics- metod för att studera rumslig genuttrycksheterogenicitet i ett vävnadsprov. Denna metod kan användas för samkartläggning av mRNA- och proteinnivåer vid en nästan encellsupplösning i färska eller frysta formaldehydfixerade vävnadsprover. DBiT-seq använder nästa generations sekvensering (NGS) och mikrofluidik . Denna metod möjliggör samtidig rumslig transkriptomisk och proteomisk analys av ett vävnadsprov. DBiT-seq förbättrar jämfört med tidigare spatial transcriptomics- applikationer som High-Definition Spatial Transcriptomics (HDST) och Slide-seq genom att öka antalet detekterbara gener per pixel, ökad cellulär upplösning och enkel implementering.

Ansökningar

I flercelliga system påverkas varje enskild cells funktion av deras rumsliga läge och omgivning. Implementering av DBiT-seq för att profilera både mRNA och proteinnivåer över en vävnad i ett rumsligt sammanhang kan således leda till en bättre förståelse av många biologiska processer. DBiT-seq kan användas inom många olika områden som onkologi , utvecklingsbiologi och patologi . Användning inom utvecklingsbiologi kan leda till en bättre förståelse av hur organogenes uppstår, och inom onkologi kan det ge mer insikt i rollen av heterogenitet i tumörbildning och progression.

Metodik

DBiT-seq använder ett mikrofluidiksystem för att leverera oligonukleotidstreckkoder i ett exakt kontrollerat mönster. Systemet applicerar två uppsättningar oligonukleotidstreckkoder (A1 – A50 och B1 – B50) vinkelrätt för att producera ett rutnät av unika streckkoder över sektionen märkt A1B1, A1B2 och så vidare.

Förberedelse av enheten

DBiT-seq kräver en specialtillverkad mikrofluidikenhet för att leverera streckkoderna. Mikrofluidik möjliggör exakt manipulering av vätskor på mikronskalan. DBiTseq-enheten är förberedd med hjälp av polydimetylsiloxan (PDMS) gjuten i en kiselwaferform. Enheten tillåter användaren att deponera de flytande reagensen i lämpliga kanaler på en makroskala utan någon speciell utrustning. Dessa reagens dras sedan med vakuum genom de 10, 25 eller 50 μm breda kanalerna över ytan av vävnadssektionen.

De andra komponenterna i DBiT-seq-enheten är två PDMS-reservoarer och ett akrylklämsystem för att hålla enheten jämnt med vävnaden.

Vävnadsberedning och antikroppsfärgning

En fördel med DBiT-seq är möjligheten att använda den på vävnadsobjektglas konserverade med formaldehyd i en process som kallas vävnadsfixering, vilket är oförenligt med andra spatial omics-metoder. Vävnader fryses, fixeras och delas i mycket tunna skivor som monteras på glasskiva. Om information om proteiner i provet önskas, färgas vävnaden först med antikroppshärledda DNA-taggar ( ADT). ADTs består av en antikropp konjugerad till en oligonukleotid som innehåller en unik streckkodssekvens och en Poly-A svanssekvens. Poly-A-svansen kommer att kännas igen av Poly-T-sekvensen på streckkod A, vilket gör att den kan associeras med en rumslig plats.

Streckkodning

Efter antikroppsfärgning (om så önskas) appliceras den första uppsättningen med 50 streckkoder på vävnadsprovet med det första mikrofluidikchippet. Varje 'A'-primer innehåller en unik streckkodssekvens, en ligeringslinker och en poly-T-sekvens. Poly-T-sekvensen binder till poly-A-svansen på mRNA i vävnadsprovet och på ADT som applicerats tidigare. Omvänd transkription genererar sedan den första cDNA- strängen som innehåller streckkoden och mRNA- eller antikroppsmärkningssekvensen. Chip B appliceras sedan på samma vävnadsglas. Chip B kommer att leverera den andra uppsättningen streckkoder vinkelrätt mot den första, vilket skapar ett rutmönster. Varje 'B'-oligonukleotid innehåller en unik streckkodssekvens, ett PCR-handtag, en ligeringslinker och biotin för cDNA-rening. Ligeringslinkersekvenserna används för att ligera streckkoder A och B tillsammans till en enda DNA-sträng. Slutligen extraherar ett lyseringssteg cDNA från vävnaden till ett poolat prov som innehåller alla streckkodade strängar.

Biblioteksförberedelser och sekvensering

cDNA-lysatet som produceras i steg 3 renas med streptavidinpärlor som känner igen biotinet på streckkod B. Den komplementära cDNA-strängen syntetiseras sedan genom omvänd transkription, följt av PCR-amplifiering och slutlig rening av biblioteket . Biblioteket sekvenseras sedan med hjälp av nästa generations (Illumina) sekvensering .

Dataanalys

Vävnadsglaset avbildas före, under och efter varje streckkodningssteg för att möjliggöra exakt association av rumslig information som erhålls från streckkoderna. Att associera streckkoderna med varje mRNA-sekvens ger en rumslig transkriptomkarta över vävnaden. Även om detta inte är en encellsmetodik, fångar 10 uM-kanalerna endast 1-2 celler per kvadrat, vilket genererar nästan encellsupplösning. ADT-sekvenserna fångar rumslig proteomisk information som kan jämföras med de transkriptomiska data. Specifika cellpopulationer kan identifieras på två sätt. Först, genom att matcha transkriptomet till tidigare encelliga RNA-seq (scRNA-seq) profiler för varje celltyp. För det andra använder spatial differential expression (SpatialDE), en mönsterigenkänningsprogramvara som kan differentiera vävnadstyper utan scRNA-seq- data.

Fördelar och begränsningar

Fördelar

DBiT-seq ger en fördel jämfört med andra spatial-omics-tekniker genom att tillåta samkartläggning av mRNA och proteiner. Detta ger både transkriptomiska och proteomiska data för analys. Tekniken kan enkelt implementeras och anpassas till forskarens behov och proteiner av intresse. Denna metod kan användas framgångsrikt på H&E och immunfärgade vävnadsprover, såväl som med formaldehydfixerade vävnadsprover. Kanalerna som används för streckkodning kan ändras för att justera för upplösningskrav från 10 μm, 25 μm och 50 μm.

Begränsningar

Upplösningen för DBiT-seq har inte encellsupplösning, men den är nära encellsupplösning. Pixelstorleken har en teoretisk gräns på ~5 μm, vilket är tillräckligt litet för att tillåta en enskild eller bråkdel av en enda cellobservation men har inte implementerats. Med de nuvarande kanalkonfigurationerna finns det en storleksbegränsning för kartläggningsområdet på en vävnad, med hjälp av 10 μm kanaler tillåter detta att endast en 1 mm × 1 mm yta av vävnaden kartläggs. För att övervinna denna begränsning kan ytterligare streckkodskanaler läggas till för att öka täckningen.

Sammanfattning

Vävnader är gjorda av heterogena populationer av celler. Att förstå hur dessa celler fungerar tillsammans och vilken roll varje celltyp har i vävnaden är viktigt inom områden som cancerforskning och utvecklingsbiologi. Medan framsteg inom enkelcellstekniker har förbättrat vår ansträngning att förstå dessa komplexa miljöer, har rumslig information saknats särskilt. Detta har förbättrats genom tillkomsten av rumslig omics. DBiT-seq tillhandahåller en tillgänglig metod för att erhålla rumslig transkriptomisk och proteomisk information från fasta eller färska vävnadssnitt. Med en upplösning på 10, 25 eller 50 μm ger DBiT-seq nästan encellsupplösning och tillhandahåller rumslig omikdata utan behov av högspecialiserad bildutrustning.