CITE-Seq
CITE-Seq ( C ellular I ndexing of T ranscriptomes and E pitopes by Sequ uencing) är en metod för att utföra RNA-sekvensering tillsammans med att få kvantitativ och kvalitativ information om ytproteiner med tillgängliga antikroppar på en enstaka cellnivå. Hittills har metoden visat sig fungera med endast ett fåtal proteiner per cell. Som sådan ger den ett ytterligare lager av information för samma cell genom att kombinera både proteomik och transkriptomikdata. För fenotypning har denna metod visat sig vara lika exakt som flödescytometri (en guldstandard) av grupperna som utvecklade den. Det är för närvarande en av huvudmetoderna, tillsammans med REAP-Seq, för att utvärdera både genuttryck och proteinnivåer samtidigt i olika arter.
Metoden etablerades av New York Genome Center i samarbete med Satija-labbet , medan ett liknande tillvägagångssätt tidigare visades av AbVitro Inc ..
Ansökningar
Samtidig mätning av både protein- och transkriptnivåer öppnar för möjligheter att använda CITE-Seq i olika biologiska områden, varav några berördes av utvecklarna. Det kan till exempel användas för att karakterisera tumörheterogenitet i olika cancerformer, ett stort forskningsfält. Det tillåter också att identifiera sällsynta subpopulationer av celler som en enkelcellsmetod med hög genomströmning och därmed upptäcka information som annars går förlorad med bulkmetoder. Det kan också hjälpa till med tumörklassificering - till exempel identifiering av nya subtyper. Alla ovanstående är möjliga på grund av encellsproduktion av både protein- och transkriptdata samtidigt, vilket också leder till ny information om protein-RNA-korrelation.
Det har också potential inom immunologi. Till exempel kan den användas för karakterisering av immunceller - nyligen genomförd forskning på T-celler har undersökt förmågan hos T-celler att upprätthålla ett effektortillstånd. En annan studie av en av CITE-Seqs medförfattare föreslog CITE-Seq som en metod för att titta på mekanismerna för värd-patogeninteraktioner.
Arbetsflöde
CITE-seq har, precis som alla andra sekvenseringstekniker, en våt labbdel, där de faktiska antikropparna prepareras, celler färgas, cDNA syntetiseras och RNA-bibliotek framställs som sekvenseras ytterligare, och en torr labbdel för analys av de erhållna sekvenseringsdata . Den mest avgörande delen i de våta laboratorieexperimenten är att designa antikropp-oligonukleotidkonjugaten och titrera mängden av varje konjugat som måste finnas i poolen för att uppnå en önskad avläsning och kvantifiering.
Våt lab arbetsflöde
Det första steget innefattar beredning av antikropp-oligo-konjugaten även kända som A ntibody -Derived T ags (ADTs) . ADT-beredning involverar märkning av en antikropp riktad mot ett cellytprotein av intresse med oligonukleotider för streckkodning av antikroppen.
När du väl har ADT:erna är nästa steg att binda cellerna med den önskade ADT-poolen. scRNA-seq-biblioteken kan framställas med användning av Drop-seq , 10X Genomics eller ddSeq-metoder. I korthet är ADT-märkta celler inkapslade i en droppe som enstaka celler med DNA-streckkodade mikropärlor.
Inom en droppe lyseras cellerna därefter för att frigöra både bundna ADTs såväl som mRNA. Dessa omvandlas sedan till cDNA. Varje DNA-sekvens på en mikropärla har en unik streckkod, vilket indexerar cDNA med cellstreckkoder. cDNA framställs från både ADT och cellulära mRNA.
I nästa steg, baserat på utvecklarens riktlinjer, PCR-amplifieras cDNA och ADT cDNA och mRNA cDNA separeras baserat på storlek (i allmänhet är ADT-härledda cDNAs < 180bp och mRNA-härledda cDNAs är > 300bp). Var och en av de separerade cDNA-molekylerna amplifieras och renas oberoende för att framställa sekvenseringsbibliotek. Slutligen slås de oberoende biblioteken samman och sekvenseras. Således kan proteomik- och transkriptomikdata erhållas från en enda sekvenseringskörning.
Arbetsflöde för torrt labb
Analys av encellssekvensering ger många utmaningar, som att bestämma det bästa sättet att normalisera data. På grund av en ny nivå av komplikationer som uppstår från sekvensering av både proteiner och transkript på encellsnivå, underhåller utvecklarna av CITE-Seq och deras samarbetspartners flera verktyg för att hjälpa till med dataanalys.
scRNA-Seq-dataanalys baserad på utvecklarens riktlinjer : De första analysstegen är desamma som i ett standard scRNA-Seq- experiment. För det första måste läsningar anpassas till ett referensgenom för en art av intresse och celler med ett mycket lågt antal transkript som kartlagts till referensen tas bort. Slutligen erhålls en normaliserad räkningsmatris med genuttrycksvärden.
ADT-dataanalys (baserat på utvecklarens riktlinjer) : CITE-seq-Count är ett Python-paket från CITE-Seq-utvecklare som kan användas för att få råräkningar. Seurat-paketet från Satija lab tillåter vidare att kombinera protein- och RNA-antal och utföra klustring på båda mätningarna, samt göra differentiell expressionsanalys mellan cellkluster av intresse. ADT-kvantifiering måste ta hänsyn till skillnaderna mellan antikropparna. Dessutom kan filtrering krävas för att minska brus, på samma sätt som scRNA-Seq- analys. Men i motsats till RNA-data, på grund av högre mängder protein i en cell, är det mindre bortfall.
Analyserna kan resultera i identifiering av nya cellkluster genom metoder som PCA eller tSNE, avgörande gener som ansvarar för en specifik cellfunktion och annan ny kunskap specifik för en fråga av intresse. Generellt sett ökar resultaten som erhålls med ADT-antal avsevärt mängden information som erhålls genom transkriptomik med en enda cell.
Anpassningar av tekniken
Tillämpningarna av antikropp-oligonukleotidkonjugat har expanderat bortom CITE-seq, och kan anpassas för provmultiplexing såväl som CRISPR -skärmar.
Cell Hashing: New York Genome Center anpassade ytterligare användningen av deras antikropp-oligonukleotidkonjugat för att möjliggöra provmultiplexering för scRNA-seq . Denna teknik kallad, Cell Hashing, använder oligonukleotidmärkta antikroppar mot allestädes närvarande cellytproteiner från ett visst vävnadsprov. I detta fall innehåller en oligonukleotidsekvens en unik streckkod som skulle vara specifik för celler från distinkta prover. Denna provspecifika celltaggning tillåter sammanslagning av sekvenseringsbiblioteken framställda från olika prover på en sekvenseringsplattform. Sekvensering av antikroppstaggarna tillsammans med det cellulära transkriptomet hjälper till att identifiera ett ursprungsprov för varje analyserad cell. En unik streckkodssekvens som används på cellhashing-antikroppen kan utformas så att den skiljer sig från en antikroppsstreckkod som finns på ADT som används i CITE-seq. Detta gör det möjligt att koppla cellhashing med CITE-seq på en enda sekvenseringskörning. Cellhashning tillåter superladdning av scRNA-seq-plattformen, vilket resulterar i en lägre kostnad för sekvensering. Det möjliggör också detektion av artefaktuella signaler från multipletter, en stor utmaning i scRNA-seq . Cellhashningsmetoden har vidare använts av Gaublomme et al. att multiplexa single-nucleus RNA-seq ( snRNA-seq ) genom att utföra nucleus hashing.
ECCITE-seq: Utökad C RISPR-kompatibel cellulär indexering av transkriptomer och epitoper genom sekvensering eller ECCITE - seq utvecklades för att tillämpa användningen av CITE-seq för att karakterisera flera modaliteter från en enda cell. Genom att modifiera det grundläggande CITE-seq-protokollet till en 5'-tag-baserad scRNA-seq-analys, kan den detektera transkriptom, immunreceptorklonotyper, ytmarkörer, providentitet och singelguide-RNA (sgRNA) från varje enskild cell. Förmågan hos ECCITE-seq att detektera sgRNA-molekyler och mäta deras effekt på genuttrycksnivåer öppnar en möjlighet att tillämpa denna teknik i CRISPR-skärmar.
Fördelar och begränsningar med CITE-seq
Fördelar: CITE-seq möjliggör simultan analys av transkriptomet såväl som proteomet av enstaka celler. Tidigare försök att koppla indexsorteringsmätningar från enstaka cellsorter med scRNA-seq var begränsade till att köra en liten provstorlek och var inte kompatibla med multiplexering och massiv parallell sekvensering med hög genomströmning. CITE-seq har visat sig vara kompatibel med högkapacitetsmikrofluidiska plattformar som 10X Genomics och Drop-seq . Den är också anpassningsbar till mikro/nano-brunnsplattformar. Att koppla den med cellhashning möjliggör tillämpning av CITE-seq på bulkprover och provmultiplexering. Dessa tekniker arbetar för att minska en total kostnad för sekvensering med hög genomströmning på flera prover. Slutligen kan CITE-seq anpassas för att detektera små molekyler, RNA-interferens, CRISPR och andra genredigeringstekniker.
Begränsningar: En av begränsningarna med CITE-Seq är förlust av platsinformation. På grund av hur cellerna behandlas är den rumsliga fördelningen av celler inom ett prov, såväl som proteiner i en cell, inte känd. Dessutom delar denna metod utmaningarna med scRNA-Seq, såsom hög mängd brus och möjliga utmaningar för att upptäcka lågt uttryckta gener. När det gäller fenotypning utgör optimering av analysen och antikroppar också ett potentiellt problem om proteiner av intresse inte ingår i de för närvarande tillgängliga panelerna. Dessutom kan CITE-Seq just nu inte detektera intracellulära proteiner. Med det nuvarande protokollet finns det många utmaningar som skulle uppstå under permeabiliseringssteget, vilket begränsar tekniken till ytmarkörer.
Alternativa metoder
- REAP-seq: Peterson et al. från Merck utvecklade en teknik liknande CITE-seq som kallas RNA Expression and Protein Sequencing assay (REAP-seq). Medan REAP-seq, på samma sätt som CITE-seq, mäter nivåer av både transkript och proteiner i en enda cell, är skillnaden mellan de två teknikerna hur antikroppen konjugeras till oligonukleotiderna. CITE-seq kopplar vanligtvis oligonukleotiden till antikroppen icke-kovalent, via streptavidinkonjugering till antikroppen och biotinkonjugering till oligonukleotiden. REAP-seq kopplar kovalent ihop antikroppen och en aminerad DNA-streckkod
- PLAYR: PLAYR eller Proximal Ligation Assay för RNA använder sig av masspektrometri för att samtidigt analysera transkriptom- och proteinnivåerna i enstaka celler. I denna teknik är både proteinerna och RNA-transkripten märkta med isotopkonjugerade antikroppar respektive isotopmärkta prober, vilket möjliggör detektering av dem på en masspektrometer