Delitto perfetto

Delitto perfetto ( italienska: [deˈlitto perˈfɛtto] ) är en genetisk teknik för in vivo platsriktad mutagenes i jäst. Detta namn är den italienska termen för "perfekt mord", och det hänvisar till teknikens förmåga att skapa önskade genetiska förändringar utan att lämna något främmande DNA i genomet .

Bakgrund

Denna teknik utvecklades av en grupp vid National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) som består av Michael A. Resnick, Francesca Storici (nu vid Georgia Institute of Technology) och L. Kevin Lewis (nu vid Southwest Texas State University). Metoden använder syntetiska oligonukleotider i kombination med den cellulära processen med homolog rekombination . Följaktligen är den väl lämpad för genetisk manipulation av jäst, som har mycket effektiv homolog rekombination. Tillvägagångssättet delitto perfetto har använts för att producera enstaka och multipla punktmutationer, genavkortningar eller -insertioner och hela gendeletioner (inklusive essentiella gener).

Fördelar

Den primära fördelen med denna teknik är dess förmåga att eliminera främmande DNA från genomet efter mutagenesprocessen. Detta säkerställer att det inte finns några selekterbara markörer eller exogena sekvenser som används för målsökning kvar i genomet som kan orsaka oförutsedda effekter.

Delitto perfetto -tekniken är också enklare jämfört med andra metoder för in vivo platsriktad mutagenes. Andra metoder kräver flera kloningssteg och omfattande DNA-sekvensering för att bekräfta mutagenes, vilket ofta är en komplicerad och ineffektiv process.

Det finns stor flexibilitet i detta tillvägagångssätt eftersom efter att CORE-kassetten har satts in (se metodöversikt för detaljer), kan flera mutationer i genen av intresse göras enkelt och snabbt.

Denna metod kan tillämpas på andra organismer där homolog rekombination är effektiv, såsom mossan Physcomitrella patens , DT40-kycklingceller eller E. coli . Dessutom kan mänskliga gener studeras och på liknande sätt genetiskt manipuleras i jäst genom att använda konstgjorda kromosomer från jäst ( YAC).

Nackdelar

Eftersom delitto perfetto -tekniken är baserad på homolog rekombination måste denna process vara funktionell i cellerna för att tekniken ska fungera. I Saccharomyces cerevisiae är RAD52 - genen väsentlig för homolog rekombination och krävs därför för delitto perfetto- metoden.

Metoden är endast användbar för tillämpningar där valbara markörer inte är nödvändiga. Mutageniserade jäststammar kan till exempel inte användas för ytterligare genetisk analys, såsom tetradanalys. Markörer skulle behöva sättas in i lämpligt ställe i en separat process.

Tekniska nackdelar

  • Kostnad för oligonukleotider
  • Mutagenes är begränsad till regionen av genomet som omger den insatta kassetten
  • Begränsat antal reportergener (begränsat av tillgängliga CORE-kassetter)
  • Låg effektivitet för vissa applikationer (t.ex. radering av viktiga gener)

Metodöversikt

Delitto Perfetto är en tvåstegsmetod för mutagenes in vivo . I det inledande steget sätts CORE-kassetten in i området av intresse genom homolog rekombination. Därefter ersätts CORE-kassetten med DNA som innehåller mutationen av intresse.

Figur 1 . CORE-kassetter för Delitto Perfetto

CORE kassetter

CORE-kassetten innehåller både en CO- omväljbar markör och RE- porter-gen. Reportergenen gör det möjligt att välja jästceller som tar emot CORE-kassetten under det första steget av processen. Den motselekterbara markören möjliggör val av jästceller som förlorar CORE-kassetten genom integrering av den muterade oligonukleotiden under det andra steget av processen.

Det finns en mängd olika CORE-kassetter att välja mellan, som innehåller en mängd reportergener, motvalsbara tillverkare och ytterligare funktioner.

Reportergener

  • kanMX4 – möjliggör tillväxt i media som innehåller Geneticin
  • hyg – möjliggör tillväxt i media som innehåller Hygromycin B .

Motvalsbara markörer

  • Kl URA3 – förhindrar tillväxt i media som innehåller 5-fluororotinsyra.
  • GAL1/10 -p53 – förhindrar tillväxt i media som innehåller galaktos . Den kodar för en toxisk mutant av p53 under en GAL1- promotor.

Ytterligare egenskaper

  • GAL1 -I- Sce I – Ökar effektiviteten av målsökning till den CORE-kassettinnehållande kromosomen i diploida celler. Den innehåller restriktionsendonukleaset SceI under GAL1- promotorn och SceI-målsekvensen.
Figur 2 . Översikt över Delitto Perfetto för genradering

Teknik arbetsflöde

Först amplifieras CORE-kassetten med PCR med primrar som innehåller regioner av homologi med det kromosomala stället där den kommer att infogas. CORE-kassetten är integrerad via homolog rekombination. Celler som innehåller CORE-kassetten kan väljas för användning av reportergenen och kan bekräftas ytterligare med hjälp av den motselekterbara markören. Integrering av CORE-kassetten i rätt kromosomal plats kan verifieras via PCR med användning av primers som hybridiserar uppströms om integrationsstället, inom CORE och nedströms integrationsstorleken, som är designade för att generera 500–1500 bp fragment.

CORE-innehållande jästceller transformeras med oligonukleotider som innehåller den önskade mutationen så att de leder till förlust av CORE-kassetten under homolog rekombination. Transformanter selekteras med användning av den motselekterbara markören och kan screenas ytterligare med användning av reportergenen. Sekvensering används för att säkerställa att korrekt mutation har genererats utan ytterligare mutationer. Alternativt, om mutationen leder till generering eller förlust av ett restriktionsställe, kan PCR följt av restriktionsdigerering användas för att bekräfta att den önskade mutationen har integrerats.

Dubbelsträngsbrott (DSB) förmedlad delitto perfetto

För att öka oligonukleotidmålriktningen till CORE-kassetten kan CORE-kassetter som innehåller GAL1 -I- Sce I-funktionen användas. Denna egenskap möjliggör uttryck av SceI, ett endonukleas som känner igen en mycket unik 18 nukleotiders sekvens som osannolikt kommer att förekomma någon annanstans i S. cerevisiae- genomet. SceI-endonukleaset kan generera en DSB vid SceI-stället som leder till rekryteringen av DNA-reparationsmaskineriet . Detta ökar frekvensen av riktad homolog rekombination med 4 000 gånger jämfört med när ingen DSB genereras.

Allmänna överväganden för oligonukleotiddesign

80–100 bp oligonukleotider kan genereras som enstaka molekyler, eller par av oligonukleotider som är helt överlappande eller delvis överlappande. Vilken typ av oligonukleotid som rekommenderas beror på typen av mutation och avståndet från CORE-kassettens integrationsställe en mutation önskas.

Längre oligonukleotider leder till ökad transformationseffektivitet. Helt komplementära oligonukleotidpar leder till en 5–10-faldig ökning av effektiviteten jämfört med enstaka oligonukleotider och rekommenderas för alla tillämpningar. Men de ger ett litet fönster av mutagenes på endast 20–40 baser från CORE-kassetten. För att öka fönstret för mutagenes kan oligonukleotidpar med en 20 bp överlappning användas, och dessa tillåter upp till 100 bp uppströms och nedströms om CORE-integrationsstället som mål. Däremot omvandlas de ungefär 6 gånger mindre effektivt. För att öka effektiviteten kan delvis överlappande oligonukleotider förlängas in vitro .

För gendeletioner

Oligonukleotider som innehåller sekvensen uppströms omedelbart följt av sekvensen nedströms om regionen som ska slås ut utformas. För gendeletioner leder par av helt överlappande 80–100 bp oligonukleotider till en 5–10-faldig ökning i transformationseffektivitet än enstaka oligonukleotider.

För punktmutationer

För mutationer 20 till 40 bp från CORE-kassetten rekommenderas 80–100 bp helt överlappande oligonukleotider. För mutationer mer än 40 bp från CORE-kassetten måste delvis överlappande oligonukleotider användas. För att öka deras transformationseffektivitet rekommenderas att delvis överlappande oligonukleotider förlängs in vitro .

För väsentliga gener

För att generera mutanter av essentiella gener kan CORE-kassetten infogas nedströms genen av intresse, men detta begränsar de regioner av genen som är tillgängliga för mutation. Alternativt kan diploida celler användas. Användning av en diploid minskar emellertid effektiviteten av oligonukleotidmålsökning på grund av närvaron av två lämpliga kromosomala platser för oligonukleotiderna att rekombinera. För att komma till rätta med denna nackdel kan den DSB-medierade delitto perfetto-metoden användas. Detta ökar frekvensen av riktad homolog rekombination med 700 gånger jämfört med när ingen DSB genereras. Dessutom är det 2–5 gånger effektivare än andra tillgängliga metoder.

Bakgrundsmutationshastigheter

Det rapporteras att när inga dubbelsträngade avbrott genereras är antalet celler som förlorar CORE-kassetten i frånvaro av en målsökande oligonukleotid mindre än en transformant per 107 livsdugliga celler. Däremot ökar detta antal upp till 100 transformanter per 107 livsdugliga celler när ett dubbelsträngat brott genereras. I en diploid inträffar de ökade bakgrundsmutationshastigheterna på grund av homolog rekombination med den homologa kromosomen, vilket minskar målinriktade transformationshändelser till endast 4% av de totala transformanterna.

  1. ^ Erdeniz N., Mortensen UH., Rothstein R. (1997) Kloningsfria PCR-baserade allelersättningsmetoder. Genome Res. 7:1174-83.
  2. ^ Langle-Rouault F., Jacobs E. (1995) En metod för att utföra exakta förändringar i jästgenomet med hjälp av en återvinningsbar selekterbar markör. Nucleic Acids Res. 23:3079-81.
  3. ^ Scherer S., Davis RW. (1979) Ersättning av kromosomsegment med förändrade DNA-sekvenser konstruerade in vitro . Proc Natl Acad Sci. 76:4951-5.
  4. ^ a b c d e f Storici F., Resnick MA. (2006) Delitto perfetto-metoden för in vivo platsriktad mutagenes och kromosomomarrangemang med syntetiska oligonukleotider i jäst. Metoder Enzymol. 409:329-45.
  5. ^ Inga A., Resnick MA. (2001) Nya humana p53-mutationer som är toxiska för jäst kan förbättra transaktivering av specifika promotorer och reaktiva tumör-p53-mutanter. Onkogen. 14;20(27):3573-9
  6. ^ a b c d e Storici F., Durham CL., Gordenin DA., Resnick MA. (2003) Kromosomala platsspecifika dubbelsträngsbrott är effektivt inriktade på reparation av oligonukleotider i jäst. Proc Natl Acad Sci. 9;100(25):14994-9
  7. ^ Plessis A., Perrin A., Haber JE., Dujon B. (1992) Platsspecifik rekombination bestämd av I-SceI, ett mitokondriellt grupp I-intronkodat endonukleas uttryckt i jästkärnan. Genetik. 130(3):451-60
  8. ^ Storici F., Resnick MA. (2003) Delitto perfetto riktad mutagenes i jäst med oligonukleotider. Genet Eng. 25:189-207
  9. ^ a b c d Storici F., Lewis LK., Resnick MA. (2001) In vivo platsriktad mutagenes med användning av oligonukleotider. Nat Biotechnol. 19(8):773-6
Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Delitto_perfetto&oldid=767646136 "