DRIP-seq

DRIP-seq (DRIP-sequencing) är en teknologi för genomomfattande profilering av en typ av DNA-RNA-hybrid som kallas en " R-loop ". DRIP-seq använder en sekvensoberoende men strukturspecifik antikropp för DNA-RNA- immunfällning (DRIP) för att fånga R-loopar för massivt parallell DNA-sekvensering .

Introduktion

R-loop och S9.6 monoklonal antikropp

En R-loop är en tresträngad nukleinsyrastruktur , som består av en DNA-RNA-hybridduplex och ett förskjutet enkelsträngat DNA (ssDNA). R-loopar bildas övervägande i cytosinrika genomiska regioner under transkription och är kända för att vara involverade i genuttryck och immunoglobulinklassbyte . De har hittats i en mängd olika arter, allt från bakterier till däggdjur. De är företrädesvis lokaliserade till CpG-ö- promotorer i humana celler och höggradigt transkriberade regioner i jäst.

Under onormala förhållanden, nämligen förhöjd produktion av DNA-RNA-hybrider, kan R-loopar orsaka genominstabilitet genom att exponera enkelsträngat DNA för endogena skador som utövas av verkan av enzymer såsom AID och APOBEC , eller överexponering för kemiskt reaktiva arter. Att förstå var och under vilka omständigheter R-loopar bildas över genomet är därför avgörande för bättre förståelse av genominstabilitet. Karakterisering av R-loop var initialt begränsad till lokusspecifika tillvägagångssätt. Men efter ankomsten av massiva parallella sekvenseringsteknologier och därefter derivat som DRIP-seq, har möjligheten att undersöka hela genom för R-loopar öppnats upp.

DRIP-seq förlitar sig på den höga specificiteten och affiniteten hos den monoklonala antikroppen S9.6 (mAb) mot DNA-RNA-hybrider av olika längder. S9.6 mAb skapades och karakteriserades först 1986 och används för närvarande för selektiv immunoutfällning av R-loopar. Sedan dess har det använts i olika immunoutfällningsmetoder för R-loopkarakterisering. Konceptet bakom DRIP-seq liknar ChIP-sekvensering ; R-loop-fragment är det huvudsakliga immunoutfällda materialet i DRIP-seq.

Användningar och aktuell forskning

DRIP-seq används främst för genomomfattande kartläggning av R-loopar. Identifiering av R-loop-bildningsplatser gör det möjligt att studera olika cellulära händelser, såsom funktionen av R-loop-bildning i specifika regioner, karakteriseringen av dessa regioner och påverkan på genuttryck. Den kan också användas för att studera inverkan av R-loopar i andra processer som DNA-replikation och syntes. Indirekt kan DRIP-seq utföras på muterade cellinjer som saknar gener involverade i R-loopupplösning. Dessa typer av studier ger information om den muterade genens roller för att undertrycka DNA-RNA-bildning och potentiellt om betydelsen av R-loopar i genominstabilitet.

DRIP-seq användes först för genomomfattande profilering av R-loopar hos människor, vilket visade utbredd R-loopbildning vid CpG-ö-promotorer. Särskilt fann forskarna att R-loopbildning är associerad med det ometylerade tillståndet på CpG-öarna.

DRIP-seq användes senare för att profilera R-loop-bildning vid transkriptionsstart- och termineringsställen i humana pluripotenta Ntera2-celler . I denna studie avslöjade forskarna att R-loopar på 3'-ändarna av gener kan vara korrelerade med transkriptionsterminering.

Arbetsflöde för DRIP-seq

Genomisk DNA-extraktion

Först extraheras genomiskt DNA (gDNA) från celler av intresse genom proteinas K-behandling följt av fenol-kloroformextraktion och etanolutfällning . Ytterligare zymolyasspjälkning är nödvändig för att jästceller ska ta bort cellväggen innan proteinas K- behandling. gDNA kan också extraheras med en mängd andra metoder, såsom kolonnbaserade metoder .

Genomisk DNA-fragmentering

gDNA behandlas med S1-nukleas för att avlägsna oönskat ssDNA och RNA , följt av etanolutfällning för att avlägsna S1-nukleaset. Sedan fragmenteras gDNA med restriktionsendonukleas , vilket ger dubbelsträngade DNA (dsDNA)-fragment av olika storlekar. Alternativt kan gDNA-fragment genereras genom sonikering .

Immunfällning

Fragmenterat gDNA inkuberas med den DNA-RNA-strukturspecifika S9.6 mAb. Detta steg är unikt för DRIP-seq-protokollet, eftersom det helt förlitar sig på den höga specificiteten och affiniteten hos S9.6 mAb för DNA-RNA-hybrider. Antikroppen kommer att känna igen och binda dessa regioner spridda över genomet och kommer att användas för immunoutfällning. S9.6-antikropparna är bundna till magnetiska pärlor genom att interagera med specifika ligander (dvs protein A eller protein G ) på ytan av pärlorna. Således kommer de DNA-RNA-innehållande fragmenten att binda till pärlorna med hjälp av antikroppen.

Eluering

De magnetiska pärlorna tvättas för att avlägsna eventuellt gDNA som inte är bundet till pärlorna genom en serie tvättar och DNA-RNA-hybrider utvinns genom eluering. För att avlägsna antikroppen bunden till nukleinsyrahybriderna utförs proteinas K-behandling följt av fenol-kloroformextraktion och etanolfällning. Detta resulterar i isolering av renade DNA-RNA-hybrider av olika storlekar.

Sekvensering

För massiv parallell sekvensering av dessa fragment sonikeras det immunutfällda materialet, storleksselekteras och ligeras till streckkodade oligonukleotidadaptrar för klusteranrikning och sekvensering.

Beräkningsanalys

För att detektera ställen för R-loop-bildning justeras de hundratals miljoner sekvenseringsläsningarna från DRIP-seq först till ett referensgenom med en kortläst sekvensaligner , sedan kan toppanropsmetoder utformade för ChIP-seq användas för att utvärdera DRIP signaler. Om olika cocktails av restriktionsenzymer användes för olika DRIP-seq-experiment av samma prov, kallas konsensus DRIP-seq-toppar. Typiskt jämförs toppar med de från ett motsvarande RNase Hl -behandlat prov, som fungerar som en ingångskontroll.

Begränsningar

På grund av frånvaron av en annan antikroppsbaserad metod för R-loop-immunfällning är validering av DRIP-seq-resultat svårt. Däremot kan resultat från andra R-loop-profileringsmetoder, såsom DRIVE-seq, användas för att mäta konsensus.

Å andra sidan förlitar sig DRIP-seq på befintliga kortlästa sekvenseringsplattformar för sekvensering av R-loopar. Med andra ord, alla inneboende begränsningar av dessa plattformar gäller även för DRIP-seq. I synnerhet skulle typiska kortlästa sekvenseringsplattformar producera ojämn lästäckning i GC-rika regioner. Sekvensering av långa R-loopar kan utgöra en utmaning eftersom R-loopar huvudsakligen bildas i cytosinrika DNA-regioner. Dessutom tenderar GC-rika regioner att ha låg komplexitet av naturen, vilket är svårt för kortläsade aligners att producera unika anpassningar.

Andra R-loop profileringsmetoder

Även om det finns flera andra metoder för analys och profilering av R-loop-bildning, är det bara få som ger täckning och robusthet i genom-omfattande skala.

Icke-denaturerande bisulfitmodifiering och sekvensering : Denna metod består av bisulfitbehandling följt av sekvensering och bygger på den mutagena effekten av natriumbisulfit på ssDNA. Även om denna metod främst används för att lokalisera specifika CpG-ö-promotorer, användes den för att detektera R-loopar i mindre skala och andra ssDNA-bräckliga platser.
DNA:RNA In Vitro-anrikning (DRIVE-seq) : Denna metod delar mycket liknande principer för DRIP-seq förutom användningen av MBP-RNASEH1-endonukleas istället för S9.6 mAb för återhämtning av R-loopar. MBP-RNASEH1 tillhandahåller ett alternativ till S9.6 mAb när en ytterligare infångningsanalys behövs, men överuttryck av detta endonukleas kan introducera cytotoxiska risker in vivo .
DNA:RNA immunutfällning följt av hybridisering på mikroarray (DRIP-chip) : Denna metod bygger också på användningen av S9.6 mAb. Men istället för att gå in i en sekvenseringspipeline, hybridiseras det immunutfällda materialet i DRIP-chipet till en mikroarray . En fördel med DRIP-chip framför DRIP-seq är den snabba erhållandet av data. De begränsande faktorerna för denna teknik är antalet prober på chipets mikroarrayer och frånvaron av DNA-sekvensinformation.

Se även