DNA-riktad RNA-interferens
DNA-riktad RNA-interferens (D RNAI) är en gen-tystnadsteknik som använder DNA- konstruktioner för att aktivera en djurcells endogena RNA-interferens (RNAI) vägar. DNA-konstruktioner är designade för att uttrycka självkomplementära dubbelsträngade RNA , typiskt kort hårnåls-RNA, som en gång bearbetade åstadkommer tystnad av en eller flera målgener. Vilket RNA som helst, inklusive endogent budbärar-RNA (mRNA) eller viralt RNA, kan tystas genom att designa konstruktioner för att uttrycka dubbelsträngat RNA som är komplementärt till det önskade mRNA -målet.
Denna mekanism har visat sig fungera som ett nytt terapeutiskt medel för att tysta sjukdomsframkallande gener över en rad sjukdomsmodeller, inklusive virussjukdomar som HIV , hepatit B eller hepatit C , eller sjukdomar associerade med förändrat uttryck av endogena gener som läkemedels- resistent lungcancer , neuropatisk smärta , avancerad cancer och retinitis pigmentosa .
ddRNAi-mekanism
Till skillnad från små interfererande RNA ( siRNA )-terapier som vänder inuti en cell och följaktligen endast tystar gener tillfälligt, transkriberas DNA-konstruktioner kontinuerligt, vilket fyller på den cellulära "dosen" av shRNA, vilket möjliggör långvarig tystnad av målgener. ddRNAi-mekanismen erbjuder därför potentialen för pågående kliniska fördelar med minskad medicinsk intervention.
Organisation av ddRNAi-konstruktioner
Figur 2 illustrerar den vanligaste typen av ddRNAi-DNA-konstruktion, som är utformad för att uttrycka ett shRNA. Denna består av en promotorsekvens, som driver uttryck av sens- och antisenssekvenser separerade av en loopsekvens, följt av en transkriptionell terminator. Antisensarterna som bearbetas från shRNA:t kan binda till mål-RNA:t och specificera dess nedbrytning. shRNA-konstruktioner kodar vanligtvis för sense- och antisenssekvenser på 20 – 30 nukleotider. Flexibilitet i konstruktionsdesign är möjlig: till exempel kan positionerna för sense- och antisenssekvenser vändas om, och andra modifieringar och tillägg kan förändra intracellulär shRNA-bearbetning. Dessutom kan en mängd olika promotorslingor och terminatorsekvenser användas.
En särskilt användbar variant är en multikassett (Figur 2b). Designade för att uttrycka två eller flera shRNA, kan de rikta in sig på flera sekvenser för nedbrytning samtidigt. Detta är en särskilt användbar strategi för att rikta in sig på virus. Naturliga sekvensvariationer kan göra en enda shRNA-målplats oigenkännlig, vilket förhindrar RNA-nedbrytning. Multikassettkonstruktioner som riktar sig till flera platser inom samma virala RNA kringgår detta problem.
Leverans
Leverans av ddRNAi-DNA-konstruktioner förenklas genom att det finns ett antal kliniskt godkända och välkarakteriserade genterapivektorer utvecklade för ändamålet. Leverans är en stor utmaning för RNAi-baserad terapi med nya modifieringar och reagens som kontinuerligt utvecklas för att optimera målcellsleverans. Två breda strategier för att underlätta leverans av DNA-konstruktioner till de önskade cellerna är tillgängliga: dessa använder antingen virala vektorer eller en av ett antal klasser av transfektionsreagens .
In vivo- leverans av ddRNAi-konstruktioner har visats med användning av en rad vektorer och reagens med olika administreringsvägar (ROA).
ddRNAi-konstruktioner har också framgångsrikt levererats till värdceller ex vivo och sedan transplanterats tillbaka till värden.
Till exempel, i en klinisk fas I-studie vid City of Hope National Medical Center , Kalifornien, USA, behandlades fyra HIV-positiva patienter med non-Hodgkins lymfom framgångsrikt med autologa hematopoetiska stamceller förtransducerade ex vivo med ddRNAi-konstruktioner med lentiviral vektorer. Denna konstruktion designades för att uttrycka tre terapeutiska RNA, varav ett var ett shRNA, och därigenom bekämpade HIV-replikation på tre olika sätt:
- shRNA, som tystar tat- och rev-generna i HIV-genomet
- CCR5 ribozym, hämmar inträngning av virala celler
- TAR lockbete-RNA, hämmar initiering av viral transkription.
Pågående uttryck av shRNA har bekräftats i T-celler, monocyter och B-celler mer än ett år efter transplantation.
Terapeutiska applikationer
Neuropatisk smärta
Nervana är en experimentell ddRNAi-konstruktion som slår ner uttrycket av proteinkinas C gamma (PKCγ) som är känt för att vara associerat med neuropatisk smärta och morfintolerans .
Två konserverade PKCγ-sekvenser som hittats över alla nyckelmodellarter och människor har identifierats, och både enkla och dubbla DNA-kassetter har designats. In vitro tystades uttrycket av PKCy med 80 %. När liknande ddRNAi-konstruktioner levererades intratekalt med hjälp av en lentiviral vektor, visades smärtlindring i en neuropatisk råttmodell.
Läkemedelsresistent icke-småcellig lungcancer
Utvecklingen av resistens mot kemoterapier som paklitaxel och cisplatin vid icke-småcellig lungcancer ( NSCLC) är starkt förknippad med överuttryck av beta III-tubulin . Undersökningar av Children's Cancer Institute Australia ( University of NSW, Lowy Cancer Research Center ) visade att beta III-tubulin-nedbrytning av ddRNAi fördröjde tumörtillväxt och ökade kemosensitivitet i musmodeller.
Tributarna är en trippel-DNA-kassett som uttrycker tre shRNA-molekyler som var och en separat riktar sig mot beta III-tubulin och starkt hämmar dess uttryck. Studier i en ortotopisk musmodell, där konstruktionen levereras av en modifierad polyetyleniminvektor , jetPEI, som riktar sig mot lungvävnad pågår.
Hepatit B virusinfektion
Genomet för hepatit B-virus (HBV) kodar för sitt eget DNA-polymeras för replikering. Biomics Biotechnologies har utvärderat omkring 5000 siRNA-sekvenser av denna gen för effektiv knockdown; fem sekvenser valdes ut för ytterligare undersökning och visades ha potent tystande aktivitet när de omvandlades till shRNA-expressionskassetter. En multikassettkonstruktion, Hepbarna, är under preklinisk utveckling för leverans av en adenoassocierad virus 8 (AAV-8) leverinriktad vektor.
Oculopharyngeal muskeldystrofi
Klassificerad som en föräldralös sjukdom finns det för närvarande ingen terapi för OPMD, orsakad av en mutation i genen för poly(A)-bindande protein nukleär 1 ( PABPN1 ). Att tysta den muterade genen med ddRNAi erbjuder ett potentiellt terapeutiskt tillvägagångssätt.
HIV/AIDS
Förutom ex vivo-metoden av City of Hope National Medical Center som diskuterats ovan, forskar Center for Infection and Immunity Amsterdam (CINIMA), University of Amsterdam, Nederländerna, omfattande sammansättningen av multikassett-DNA-konstruktioner för att tackla HIV.
Säkerhetsfrågor
Som med alla genterapier måste ett antal säkerhets- och toxicitetsfrågor utvärderas under utvecklingen av ddRNAi-terapi:
Onkogenaktivering genom viral insättning: Vissa genterapivektorer integreras i värdgenomet och fungerar därigenom som insertionsmutagener. Detta var ett särskilt problem med tidiga retrovirala vektorer där insättningar intill onkogener resulterade i utvecklingen av lymfoida tumörer. AAV-vektorer anses vara en låg risk för värdgenomintegrering, eftersom adenoassocierad virusinfektion inte har associerats med induktion av cancer hos människor trots utbredd prevalens i den allmänna befolkningen. Vidare har omfattande klinisk användning av AAV-vektorer inte gett några bevis på karcinogenicitet. Medan lentivirala vektorer inte integreras i genomet verkar de inte visa en benägenhet att aktivera onkogenexpression.
Immunsvar på genterapivektorer: Ett immunologiskt svar på en adenoviral vektor resulterade i att en patient dog i ett tidigt försök på människa. Noggrann övervakning av potentiella toxiciteter i prekliniska tester och analyser av redan existerande antikroppar mot genterapivektorer hos patienter minimerar sådana risker.
Medfödd immunsvar: siRNA har visat sig aktivera immunsvar genom interaktion med Toll-liknande receptorer som leder till interferonsvar. Dessa receptorer finns på cellytan och så ddRNAi-konstruktioner – som levereras direkt till intracellulärt utrymme – förväntas inte inducera detta svar.
Toxiska effekter på grund av överuttryck av shRNA: Högnivåuttryck av shRNA har visat sig vara toxiskt. Strategier för att minimera nivåer av shRNA-uttryck eller främja exakt bearbetning av shRNA kan övervinna detta problem.
Effekter utanför målet: Oavsiktlig tystnad av gener som delar sekvenshomologi med uttryckta shRNA kan teoretiskt sett inträffa. Noggrant urval av shRNA-sekvenser och noggrann preklinisk testning av konstruktioner kan kringgå detta problem.
Vidare läsning
- Ris, RR; Muirhead, AN; Harrison, BT; Kassianos, AJ; Sedlak, PL; Maugeri, NJ; Goss, PJ; Davey, JR; James, DE; Graham, MW (2005). Enkla, robusta strategier för att generera DNA-riktade RNA-interferenskonstruktioner . Metoder inom enzymologi. Vol. 392. s. 405–419. doi : 10.1016/S0076-6879(04)92024-1 . ISBN 9780121827977 . PMID 15644195 .
- Liu, YP; Westerink, JT; Broms, O.; Berkhout, B. (2011). "RNAi-inducerande lentivirala vektorer för anti-HIV-1 genterapi". Antiviralt RNAi . Metoder i molekylärbiologi. Vol. 721. s. 293–311. doi : 10.1007/978-1-61779-037-9_18 . ISBN 978-1-61779-036-2 . PMID 21431693 .