DNA-ändresektion

DNA-ändresektion , även kallad 5′–3′-nedbrytning , är en biokemisk process där den trubbiga änden av en sektion av dubbelsträngat DNA (dsDNA) modifieras genom att skära bort några nukleotider från 5'-änden för att producera en 3'-singel -strängad sekvens. Närvaron av en sektion av enkelsträngat DNA (ssDNA) gör att den trasiga änden av DNA:t kan linjera exakt med en matchande sekvens, så att den kan repareras korrekt.

Mekanism för reglering av 5'-resektion av mitotiska och telomera DSB.

Dubbelsträngsbrott (DSB) kan inträffa i vilken fas som helst av cellcykeln vilket gör att DNA-ändresektion och reparationsaktiviteter äger rum, men de är också normala mellanprodukter i mitosrekombination . Dessutom liknar de naturliga ändarna av de linjära kromosomerna DSB, och även om DNA-avbrott kan orsaka skada på integriteten hos genomiskt DNA, packas de naturliga ändarna i komplexa specialiserade DNA-skyddande förpackningar som kallas telomerer som förhindrar DNA- reparationsaktiviteter . Telomerer och mitotiska DSB har olika funktionalitet, men båda upplever samma 5′–3′ nedbrytningsprocess.

Bakgrund

Ett dubbelsträngsbrott är en sorts DNA-skada där båda strängarna i dubbelspiralen klipps av. DSB förekommer endast under DNA-replikation av cellcykeln . Dessutom kan DSB leda till genomomarrangemang och instabilitet. Fall där två komplementära strängar är kopplade vid punkten av DSB har potential att vara katastrofala, så att cellen inte kommer att kunna fullborda mitos när den delar sig nästa gång, och kommer antingen att dö eller, i sällsynta fall, genomgå kromosomförlust, duplikationer och även mutationer . Det finns tre mekanismer för att reparera DSB:er: icke-homolog ändfogning (NHEJ), mikrohomologi-medierad ändfogning (MMEJ) och homolog rekombination HR. Av dessa är det bara NHEJ som inte förlitar sig på DNA-ändresektion.

Mekanism

Noggrann reparation av DSB:er är avgörande för att upprätthålla genomets integritet. Från de tre mekanismer som finns för att reparera DSB, är NHEJ och HR reparationsmekanismer de dominerande vägarna. Flera mycket konservativa proteiner utlöser DNA Damage Checkpoint för detektering av DSB som följer på reparation genom antingen NHEJ- eller HR-reparationsvägar. NHEJ-mekanismen fungerar vid ligering av två olika DSB:er med hög kvalitet, medan HR förlitar sig på en homolog mall för att reparera DSB-ändar.

DNA-ändresektion i HR-vägen sker endast vid två specifika faser: S- och G2- faser. Eftersom HR-vägen kräver systerkromatider för aktivering, inträffar denna händelse endast i G2- och S-faserna av cellcykeln under replikering. DSB:er som inte har påbörjat DNA-ändresektion kan ligeras med NHEJ-vägen, men resektion av några få nukleotider hämmar NHEJ-vägen och begår DNA-reparation av HR-vägen. NHEJ-vägen är involverad under hela cellcykeln, men den är avgörande för DNA-reparation under G1- fasen. I G1-fasen finns det inga systerkromatider för att reparera DSB via HR-vägen vilket gör NHEJ-vägen till en kritisk reparationsmekanism.

Innan resektion kan ske behöver avbrottet upptäckas. Hos djur görs denna detektering av PARP1 ; liknande system finns i andra eukaryoter : i växter verkar PARP2 spela denna roll. PARP-bindning rekryterar sedan MRN-komplexet till brottstället. Detta är ett mycket konserverat komplex som består av Mre11 , Rad50 och NBS1 (känd som Nibrin i däggdjur, eller Xrs2 i jäst, där detta komplex kallas MRX-komplexet ).

Innan resektion kan starta måste CtBP1 -interagerande protein (CtIP) binda till MRN-komplexet så att den första fasen av resektionen kan påbörjas, nämligen korthållsändresektion. Efter att fosforylerad CtIP binder, kan Mre11-subenheten skära den 5'-terminerade strängen endonukleolytiskt , förmodligen cirka 300 baspar från änden, och fungerar sedan som ett 3'→5'- exonukleas för att ta bort änden av 5'-strängen .

Resektion av telomer-DSB

Linjära kromosomer är packade i komplexa specialiserade DNA-skyddande förpackningar som kallas telomerer . Telomerernas struktur är mycket konserverad och är organiserad i flera korta tandem-DNA-upprepningar. Telomerer och DSB har olika funktionalitet, så att telomerer förhindrar DNA-reparationsaktiviteter. Under telomer DNA-replikation i S/G2- och G1-faserna i cellcykeln lämnar den 3'-lagging-strängen ett kort överhäng som kallas G-tail. Telomeriskt DNA slutar vid 3' G-svansänden eftersom den 3'-eftersläpande strängen sträcker sig utan dess komplementära 5'C-ledande sträng. G-svansen tillhandahåller en viktig funktion till telomert DNA så att G-svansarna kontrollerar telomerhomeostas.

Telomerer i G1-fas

I G1-fasen av cellcykeln binder de telomerassocierade proteinerna RIF1 , RIF2 och RAP2 till telomert DNA och förhindrar tillgång till MRX-komplexet . Sådan process i S. Cerevisiae är till exempel negativt reglerad av denna aktivitet. MRX-komplexet och Ku-komplexet binder samtidigt och oberoende till DSB-ändar. I närvaro av de telomerassocierade proteinerna misslyckas MRX att binda till DSB-ändarna medan Ku-komplexet binder till DSB-ändarna. Det bundna Ku-komplexet till DSB-ändarna skyddar telomererna från nukleolytisk nedbrytning av exo1 . Detta resulterar i en hämning av telomerasförlängning vid DSB-ändarna och förhindrar ytterligare telomerverkan vid G1-fasen av cellcykeln.

Telomerer i den sena S/G2-fasen

I den sena S/G2-fasen av cellcykeln uppvisar de telomerassocierade proteinerna RIF1, RIF2 och RAP2 sin hämmande effekt genom att binda till telomert DNA. I den sena S/G2-fasen främjar proteinkinaset CDK1 (cyklinberoende) telomer resektion. Denna kontroll utövas av cyklinberoende kinaser , som fosforylerar delar av resektionsmaskineriet. Denna process lindrar den hämmande effekten av de telomerassocierade proteinerna och tillåter Cdc13 (ett bindande protein på både den eftersläpande strängen och den ledande strängen) att täcka telomert DNA. Bindningen av cdc13 till DNA undertrycker kontrollpunkten för DNA-skada och tillåter resektion att ske samtidigt som det tillåter telomerasförlängning vid DSB-ändarna.

Resektion av mitotiska DSB

En av de viktiga regulatoriska kontrollerna i mitotiska celler är att bestämma vilken specifik DSB-reparationsväg att ta. När en DSB väl detekteras rekryteras de mycket konserverade komplexen av DNA-ändarna. Om cellen är i G1-fasen av cellcykeln, förhindrar komplexet Ku resektion att inträffa och utlöser NHEJ-vägfaktorerna. DSB i NHEJ-vägen ligeras, ett steg i NHEJ-vägen som kräver DNA- ligasaktivitet av Dnl4-Lif1/XRCC4- heterodimer och Nej1/XLF-proteinet. Denna process resulterar i felbenägen religering av DSB slutar vid G1-fasen av cellcykeln.

Om cellerna är i S/G2-fas kontrolleras mitotiska DSB genom Cdk1 -aktivitet och involverar fosforylering av Sae2 Ser267. Efter fosforylering sker av Cdk1, binder MRX-komplexet till dsDNA-ändar och genererar kort ssDNA som sträcker sig i 5'-riktningen. 5' ssDNA fortsätter resektion genom aktiviteten av helikasenzymet , Sgs1-enzymet, och nukleaserna Exo1 och Dna2. Involvering av Sae2 Sar267 i DSB-bearbetning är mycket konserverad i eukaryoter, så att Sae2 tillsammans med MRX-komplexet är involverade i två huvudfunktioner: enkelsträngad hybridisering och bearbetning av hårnåls-DNA-strukturer. Liksom allt ssDNA i kärnan, beläggs den resekerade regionen först av replikationsprotein A (RPA)-komplex, men RPA ersätts sedan med RAD51 för att bilda ett nukleoproteinfilament som kan delta i sökandet efter en matchande region, vilket gör att HR kan ta plats. 3' ssDNA belagt av en RPA främjar rekryteringen av Mecl. Mec1 fosforylerar ytterligare Sae2 tillsammans med cdk1. Den resulterande fosforyleringen av Sae2 av Mec1 hjälper till att öka effekten av resektion och detta leder i sin tur till aktivering av DNA-skadekontrollpunkten.

Regulatorer

Valvägen för DNA-reparation är starkt reglerad för att garantera att celler i S/G2- och G1-fasen använder lämplig mekanism. Regulatorer i både NHEJ- och HR-vägen förmedlar lämplig DNA-reparationsresponsväg. Dessutom visar nyare studier av DNA-reparation att reglering av DNA-ändresektion styrs av aktiviteten av cdk1 i cellreplikationscykeln.

NHEJ väg

DNA-ändresektion är nyckeln för att bestämma den korrekta vägen i NHEJ. För att NHEJ-vägen ska inträffa förmedlar positiva regulatorer som Ku- och MRX-komplexet rekrytering av andra NHEJ-associerade proteiner som Tel1, Lif1, Dnl4 och Nej1. Eftersom NHEJ inte förlitar sig på slutresektion, kan NHEJ bara hända i G1-fasen av cellcykeln. Både Ku- och NHEJ-associerade proteiner förhindrar initiering av resektion.

Resektion säkerställer att DSB inte repareras av NHEJ (som sammanfogar trasiga DNA-ändar utan att säkerställa att de matchar), utan snarare genom metoder baserade på homologi (matchande DNA-sekvenser). Cyklinberoende proteinkinas såsom cdk1 i jäst fungerar som en negativ regulator av NHEJ-vägen. All aktivitet associerad med närvaron av cyklinberoende proteinkinaser hämmar NHEJ-vägen

Positiva regulatorer

Närvaron av ett ssDNA gör att den trasiga änden av DNA:t kan linjera exakt med en matchande sekvens, så att den kan repareras korrekt. För att HR-vägen ska inträffa i S- och G2-faserna av cellcykeln krävs tillgång till en systerkromatid. 5′–3′ resektion länkar automatiskt en DSB till HR-vägen. Cyklinberoende proteinkinas såsom cdk1 fungerar som en positiv regulator av HR-vägen. Denna positiva regulator främjar 5′–3′ nukleolytisk nedbrytning av DNA-ändar. Tillsammans med cdk1 fungerar MRX-komplexet, B1-cyklin och Spo11-inducerade DSB:er som positiva regulatorer för HR-vägen.

Se även