Cytokintillförselsystem
Cytokiner är polypeptider eller glykoproteiner som hjälper immunceller att kommunicera med varandra för att inducera proliferation, aktivering, differentiering och inflammatoriska eller antiinflammatoriska signaler i olika celltyper. Studier som använder cytokiner för antitumörterapier har ökat markant sedan 2000, och olika cytokiner ger unika antitumöraktiviteter. Cytokiner hindrar tumörcellsutveckling mestadels genom antiproliferativa eller proapoptotiska vägar men kan också avbryta utvecklingen indirekt genom att framkalla immunceller för att ha cytotoxiska effekter mot tumörceller. Även om det finns FDA-godkända cytokinterapier, finns det två huvudutmaningar förknippade med cytokinleverans. Den första är att cytokiner har en kort halveringstid, så frekvent administrering av höga doser krävs för terapeutisk effekt. Den andra är att systemisk toxicitet kan uppstå om de tillförda cytokinerna orsakar ett intensivt immunsvar, känd som en cytokinstorm .
Pegylerade cytokiner
Pegylering är processen att kovalent binda polyetylenglykol (PEG) till proteiner. Pegylering förlänger halveringstiden för det bundna proteinet, vilket leder till förlängd leverans. Detta är fördelaktigt eftersom lägre, mindre frekvent dosering kommer att behövas för att ha samma terapeutiska effekt hos patienten, vilket kommer att begränsa cytotoxiciteten hos tillförselsystemet. Pegfilgrastim är ett framgångsrikt exempel på detta leveranssystem. Pegfilgrastim är den pegylerade formen av den granulocyt-kolonistimulerande faktorn ( G-CSF) filgrastim . Pegfilgrastim stimulerar produktion och frisättning av neutrofiler hos patienter som upplever benmärgstoxicitet efter att ha fått myelosuppressiva läkemedel mot cancer eller strålning. Filgrastim har en halveringstid på 3-4 timmar, medan Pegfilgrastim har en halveringstid på 45 timmar. Detta är mycket bekvämare för patienterna, eftersom de bara behöver en dos Pegfilgrastim istället för flera doser Filgrastim utdragna under en lång period. Ciliär neurotrofisk faktor (CNTF) är ett cytokin som används för att bekämpa diabetessymptom som aptitminskning och viktminskning. En pegylerad version av CNTF bibehöll biologisk aktivitet in vitro och hade förbättrad farmakokinetik. Den pegylerade CNTF minskade också glykemi hos diet-inducerade feta djur, med en dos 10 gånger högre än omodifierad CNTF. Dessa studier visar att pegylerade cytokiner kan användas för ihållande tillförsel av cytokiner, vilket ökar det terapeutiska fönstret för dessa behandlingar.
Ett stort problem orsakat av pegylering är att cytokinet kan ändra sin molekylära konformation, aktivitet och biotillgänglighet vid PEG-bindning. Cytokiner är fördelaktiga på grund av sina små storlekar, vilket gör att de kan nå intracellulära mål. PEG-bindning till cytokiner kan göra att de blir för skrymmande för att nå sina specifika mål, vilket bör beaktas vid design av pegylerade cytokiner.
GAG-baserade biomaterial
Glykosaminoglykaner (GAG) är naturligt härledda polysackarider med distinkta sekvenser av disackarider. GAG binder till cytokiner och reglerar cellrekrytering, inflammation och vävnadsremodellering genom att leverera cytokiner till den extracellulära matrisen. Bindningsstudier tyder på att GAG har en naturlig affinitet för cytokiner, och cytokinbindning till GAG medieras av ospecifika elektrostatiska interaktioner mellan positivt laddade domäner på cytokiner och negativt laddade sulfat- och karboxylsyrarester på GAG. GAG- heparinet har undersökts omfattande för cytokinleverans. Heparinbaserade hydrogeler har visat sig ge varaktig leverans av IL-4 i mer än 2 veckor, vilket leder till ett större antiinflammatoriskt svar än IL-4 enbart. En annan studie använde ett starPEG-heparinhydrogelsystem för att leverera vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och fibroblasttillväxtfaktor ( FGF-2). Den stora koncentrationen av heparin gjorde att laddning och frisättning av cytokinerna kunde vara oberoende av varandra. Samleveransen av cytokinerna från hydrogelerna ledde till pro-angiogena effekter både in vitro och in vivo, med effekten mycket större än administrering av de enskilda tillväxtfaktorerna
Immuncytokiner
Antikroppskonjugering är en annan lovande metod för cytokinleverans. Antikroppskonjugering till cytokiner kan användas för att förbättra platsspecifik leverans och förlänga cytokinhalveringstiden. Immuncytokiner levereras systemiskt men kan specifikt rikta in sig på tumören genom överuttryckta eller unika tumörantigener, kryptiska extracellulära matrisepitoper som endast finns i tumörer eller neovaskulaturmarkörer som indikerar tumörangiogenes. Cergutuzumab amunaleukin (CEA-IL2v) är ett antikropp-cytokinkonjugat som länkar cytokinet IL-2 med en antikropp som riktar sig mot det karcinoembryonala antigenet (CEA). Detta konjugat riktar sig företrädesvis mot tumörens mikromiljö för att öka lokal leverans av IL-2 och minimera toxicitet utanför målet. CEA-IL2v pågår kliniska fas I-prövningar för att behandla solida maligniteter som uttrycker CEA. En annan immuncytokin är huBC1-IL12, som utvecklades för att rikta in sig på ED-B-domänen av fibronektin. Denna domän är överuttryckt i tumörvävnader men kan inte detekteras i nästan alla normala vuxna vävnader. Systemisk administrering av huBC1-IL12 eliminerade experimentella PC3-metastaser och undertryckte tillväxten av flera humana tumörlinjer i immunförsvagade möss mer effektivt än IL-12 enbart. En fas I-studie studerade säkerheten av veckovisa infusioner av huBC1-IL12 hos patienter med njurkarcinom och malignt melanom. Den maximalt tolererade dosen visade sig vara 15 ug/kg, vilket är 30 gånger högre än den maximalt tolererade dosen av enbart IL-12
Systemiskt administrerade immuncytokiner kommer sannolikt att signifikant minska cytokinrelaterad cytotoxicitet, men inte eliminera den. Immuncytokiner interagerar fortfarande med immunceller för att inducera signalering utanför tumören, och det finns problem med ospecifik bindning i icke-målvävnader som kan störa normala immunfunktioner i kroppen. Eftersom immuncytokiner är främmande för kroppen kan de också orsaka en immunreaktion som producerar anti-immuncytokine antikroppar som leder till farmakologisk upphävande, terapeutisk förändring eller överkänslighetsreaktioner.
Icke-virala nanopartiklar
Tillförselsystem för nanopartiklar är populära på grund av deras förmåga att kapsla in föreningar utan att påverka bioaktiviteten, och de uppvisar kontrollerad och fördröjd frisättning av de inkapslade föreningarna till målvävnader. Nanopartiklar kan vara gjorda av organiska eller oorganiska medel och har förmågan att stabilisera cytokiner in vivo , öka aktiviteten vid målstället, förbättra vattenlösligheten och minska systemisk toxicitet. Lösningsmedel, pH, temperatur, laddning och storlek är många parametrar som påverkar inkapslingseffektiviteten, nanopartikeltoxiciteten och cytokinstabiliteten. Cytokiner kan inkapslas, adsorberas eller konjugeras till nanopartikelsystem för leverans, och det finns flera nanopartikelsystem som kan användas för cytokinleverans
Polymera nanopartiklar är biokompatibla, har låg toxicitet och är biologiskt nedbrytbara. De kan användas för att förbättra cirkulationstider, stabilitet och inkapslingskapacitet jämfört med andra nanopartikelsystem. Polymjölk-samglykolsyra (PLGA) är den mest populära polymeren för tillförselsystem för nanopartiklar på grund av dess enkla syntes med olja-i-vatten-metoden, höga stabilitet, enkel inkapsling eller adsorption av både hydrofoba och hydrofila molekyler och enkel ytmodifiering . PLGA-PEG nanopartiklar som inkapslar IL-10 skapades för att förhindra plackbildning i avancerade aterosklerosskador. PLGA laddades vid sina terminala delar för bättre elektrostatisk interaktion med IL-10 medan PEG användes för att funktionalisera nanopartikeln. Dessa PLGA-PEG-IL-10 nanopartiklar möjliggjorde större stabilitet och förlängd systemisk cirkulation av IL-10 och visade ingen in vitro eller in vivo cytotoxicitet.
Liposomer är en annan typ av tillförselsystem för nanopartiklar som studeras brett. Liposomer kan lätt passera lipiddubbelskikt och cellmembran men elimineras vanligtvis snabbt in vivo om de inte stabiliseras med PEG eller annan polymer. Bildandet av liposomer kan också ge problem, eftersom giftiga lösningsmedel, höga temperaturer och lågt pH kan minska biosäkerheten för nanopartiklarna eller denaturera cytokinet som levereras. Konjugering av cytokiner till liposomala ytor är ett användbart tillvägagångssätt eftersom det tillåter cytokiner att binda till sina respektive målcellsreceptorer och tillåter att flera läkemedel levereras för att potentiera den önskade effekten. Konjugering av cytokiner till ytan av lipider görs vanligtvis med användning av skikt-för-skikt-teknik som involverar skiktning av polymermaterial för att skapa en tunn film som kan reglera materialegenskaperna hos bäraren. Fördelarna med denna nanopartikeldesign inkluderar flera läkemedelsfack för sekventiell lastfrisättning, förmågan att skräddarsy ytkemi med polymerlager för att påverka målsökning och biodistribution, och förbättrad farmakokinetik. Rationellt konstruerade lager-för-lager nanopartiklar visade hög belastning och frisättning av aktiv IL-12 , lokalisering av nanopartiklar på ytan av tumörceller som gör det möjligt för IL-12 att vara tillgänglig för membranreceptorer och minskad systemisk exponering. Dessa lager-för-lager lipid-nanopartiklar minskade signifikant IL-12-toxiciteten och visade antitumöraktivitet mot kolorektala och ovarietumörer vid doser som inte tolererades med fri IL-12-tillförsel
Guldnanopartiklar blir allt mer populära eftersom de uppvisar högt förhållande mellan yta och volym, de kan enkelt resa till målceller och de stöder hög läkemedelsbelastning. De kan också enkelt funktionaliseras och syntetiseras. Guldbunden tumörnekrosfaktor (TNF) är i fas I-studier för behandling av solida tumörer. Försöket fann att guldbunden TNF har en tolerabel dos som är tre gånger högre än den tolererbara dosen för omodifierad TNF. Det fanns också högre läkemedelskoncentration i tumörvävnaden, vilket tyder på ökad lokal leverans till tumörens mikromiljö. Guldnanopartiklar kan framkalla ett immunsvar som hindrar deras effektivitet, så det är viktigt att utvärdera cellulärt svar som cytokinproduktion och produktion av reaktiva syreämnen
Kiselnanopartiklar har också utvärderats för cytokinleverans på grund av deras höga kolloidala stabilitet, omfattande ytfunktionalisering och möjlighet att kontrollera både struktur och porstorlek. Kiselnanopartiklar har dock begränsningar för cytokinleverans på grund av den låga internaliseringseffektiviteten för större biomolekyler. Denna utmaning kan övervinnas genom att utveckla mesoporösa kiseldioxidnanopartiklar med extra stora porer. Dessa nanopartiklar användes för att leverera IL-4 för att inducera M2 makrofagpolarisering för antiinflammatoriska och vävnadshomeostasterapier. Dessa nanopartiklar ökade IL-4 halveringstid, visade minimal toxicitet, laddade och levererade effektivt IL-4 och stimulerade M2 makrofagpolarisering
Plasmidnanopartiklar
Nukleinsyror är mycket lättare att producera, rena och manipulera än rekombinanta cytokiner och erbjuder en metod för att leverera dem lokalt och hållbart. Plasmidnanopartiklar som uttrycker cytokiner i kombination med elektroporering undersöks för närvarande för cytokinleverans. Elektroporering ökar tillfälligt cellmembranens permeabilitet utan att skada membranstrukturen. IL-12 är ett cytokin som är känt för att ha antitumöregenskaper men visar allvarliga dosrelaterade toxiciteter hos många patienter. Intratumoral leverans av en plasmid som kodar för IL-12 följt av elektroporering i en murin melanommodell resulterade i en botningshastighet på 47 %. En fas II-studie undersökte säkerheten och aktiviteten hos plasmid som kodar för IL-12 följt av elektroporering för att behandla stadium III/IV ooperbart melanom. Medianöverlevnaden var 3,7 månader med en objektiv total svarsfrekvens på 29,8 %, inklusive två fullständiga svar. Inga grad IV-händelser rapporterades och biverkningar var sällsynta
Andra DNA-komplex som utvärderas för att förbättra cytokinleverans inkluderar lipoplex , polyplex och lipopolyplex, som är komplex av lipider, polymerer respektive lipider med polymerer. Polyetylenimin (PEI) är en mycket katjonisk polymer som komplexbinder med negativt laddat DNA. PEI skyddar DNA från nedbrytning in vivo, främjar interaktion med negativt laddade cellmembran och ökar frisättningen från lysosomer genom att fungera som en protonsvamp. PEI:IL-12-komplex visades transfektera lungvävnad efter leverans via nebulisering, vilket ledde till produktion av IL-12 i lungorna. Administrering av PEI:IL-12 veckovis eller två gånger i veckan visade sig undertrycka eller eliminera lungmetastaser av SAOS-2 humana osteosarkom hos atymiska nakna möss. I en annan studie skapades nanopartiklar med ett liposomalt skal och två DNA som kodar för komplementära sekvenser som kärnan. Det liposomala skalet utformades för att brytas ned av fosfolipas A2 (PLA2), som överuttrycks av olika tumörer. Cytokinet TRAIL laddades på de Ni2 + -modifierade DNA-kärnorna. Vid interaktion med PLA2 omvandlades DNA-nanopartiklarna till nanofibrer för att leverera TRAIL till dödsreceptorer på cancercellmembranet. Leverans av TRAIL förstärkt apoptotisk signalering med minskad TRAIL internalisering för att förbättra antitumöreffektiviteten
Virala system
Onkolytiska virus infekterar företrädesvis maligna celler, vilket inducerar immunogen celldöd. Onkolytiska virus inkluderar adenovirus, Herpes simplex-virus, Semliki skogsvirus, poxvirus, bland andra. De kan ändras för att optimera distributionen och underlätta leverans till målvävnader. Cytokin-laddade onkolytiska virus har visat aktivitet i murina modeller, med flera kliniska prövningar under utredning. IMLYGIC (talimogene laherparepvec) var det första FDA-godkända onkolytiska viruset för cancerbehandling. Det är ett modifierat herpes simplex-virus-1 som uttrycker granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor ( GM-CSF) för återkommande melanom. Det studeras för närvarande för mjukdelssarkom och levercancer och för kombination med immunterapier. Adenovirus är allmänt studerade för cytokinleverans. I prekliniska prövningar förmedlade intratumorala injektioner av adenovirus som kodar för IL-12 (Ad-IL-12) regression av murina kolorektala karcinom, bröstkarcinom, prostatakarcinom, gliom, urinblåsekarcinom, fibrosarkom, larynxcellscancer, hepatomas, squamous carcinom och hepatomas. sköldkörtelkarcinom, sköldkörtelfollikelcancer och Ewings sarkom. Antitumörimmunsvaret hos Ad-IL-12 medieras primärt av CD8+ T-celler.
Det finns många begränsningar förknippade med virusbaserade leveranssystem. Antivirala antikroppar skulle kunna produceras mot virala cytokinavgivningssystem, vilket leder till fördröjda överkänslighetssvar, vilket kan förhindra upprepad dosering. Det finns också en stor skillnad i mottagligheten som patienter har för virusinfektioner eftersom viral leverans av cytokiner kräver transfektion av värdceller, vilket är mycket varierande från patient till patient. Det har också setts signifikant off-target transgen uttryck i kliniska prövningar. Små volymer av intratumoral injektion av adenovirus visade sig orsaka signifikant transgenexpression i lever, tarm, mjälte, njure och hjärna.
Activity-on-Target Cytokiner
Activity-on-Target-cytokiner, kända som AcTakines, är muterade cytokiner som har minskad bindningsaffinitet för sitt naturliga receptorkomplex och förbättrad bindningsaffinitet för en specifik tumörcellsreceptor. Detta gör att cytokinet är inaktivt i cirkulationen, vilket begränsar systemisk toxicitet. Cytokinet aktiveras vid bindning till dess tumörspecifika antigen, vilket möjliggör lokal leverans. Cytokintumörnekrosfaktorn ) orsakar snabb hemorragisk tumörnekros i både djurmodeller och patienter men är associerad med höga systemiska toxiciteter. TNF är känt för att utöva sin antitumöreffekt genom stromaceller i tumörmikromiljön. En TNF AcTakine skapades för att förbättra lokaliserad leverans av TNF och minska systemisk toxicitet genom att ändra dess antitumörväg till målendotelceller. Detta muterade TNF-cytokin visade sig endast rikta in sig på endotelceller i tumörens kärlsystem, vilket möjliggör ett säkert och effektivt tillförselsystem. Detta TNF-baserade AcTakine resulterade i en 100-faldig ökning av målinriktningseffektiviteten, och när AcTakine riktades mot CD13 uttryckt på endotelceller i tumörkärlen, visade det selektiv aktivering av tumörneovaskulatur utan någon detekterbar toxicitet in vivo . När den administrerades med CAR-T-celler visades denna terapi förbättra T-cellsinfiltrationen för att kontrollera solida tumörer, medan kombination med ett CD8-riktat typ II-interferon AcTakine ledde till utrotning av solida tumörer
Cytokinfabriker
Cytokinfabriker är cellgenererade cytokiner som lokalt kan leverera ett cytokin av intresse, vilket ger rumslig och tidsmässig kontroll av doseringen. Målsökningskapaciteten och tumörtropismförmågan hos mesenkymala stam-/stromaceller ( MSC) gör dem till idealiska läkemedelsleveranser. MSC:er har också minskad immunogenicitet på grund av deras begränsade uttryck av samstimulerande molekyler. Att använda MSC för att uttrycka cytokiner ger större cytokinleverans till tumörvävnaden, vilket ökar behandlingens terapeutiska effektivitet. IL-2 genmanipulerade MSCs (MSC-IL-2) har studerats som en potentiell antitumörterapi eftersom IL-2 är ett immunogent cytokin. Intratumoral injektion av MSC-IL-2 visade sig signifikant regressera gliomtumörtillväxt och förbättra den totala överlevnaden för råttor med gliom. På liknande sätt påverkade subkutana injektioner av benmärg MSC-IFN-α tumörtillväxt in vivo och ökade den totala överlevnaden i en musmodell med multipelt myelom. Antitumöreffekter tillskrevs ökad apoptos av tumörceller, minskad mikrokärldensitet och ischemisk nekros. TRAIL är ett immunogent cytokin som selektivt riktar sig mot tumörceller för apoptos, vilket minskar systemisk toxicitet. MSCs konstruerade för att överuttrycka TRAIL har visat lovande antitumöreffekter i xenograftmodeller genom apoptotiska vägar. Många studier av MSC-TRAIL-system pågår, inklusive behandlingar för neuroblastom, icke-småcelligt lungkarcinom, bröstcancer, pankreascancer, glioblastom och multipelt myelom, bland annat
Humana retinala pigmenterade epitelceller (RPE) celler kan också konstrueras för att uttrycka ett cytokin av intresse. RPE-celler är idealiska cytokinavgivningssystem eftersom de är icke-tumörframkallande, uppvisar kontakthämning, är mottagliga för genetisk modifiering, har tidigare använts i mänskliga försök för terapeutiska tillförselsystem och är säkra att använda. RPE-celler konstruerade för att producera olika cytokiner inkapslades i alginatbaserade mikropartiklar. De inkapslade cellerna kommer fortfarande att vara livskraftiga efter inkapsling, delade sig inte inuti kapslarna, producerade cytokinet av intresse och kvarstod längre in vivo än oinkapslade celler. De IL-2- producerande RPE-cellerna utrotade peritoneala tumörer i äggstocks- och kolorektala musmodeller, och beräkningsmodellering av farmakokinetik, förutsäger klinisk översättning till människor, vilket indikerar potentiell framgång i framtida humana kliniska prövningar