Cytochrome P450 teknik

Den här artikeln täcker proteinutveckling av cytokrom (CYP) P450-enzymer . P450s är involverade i en rad biokemiska kataboliska och anabola processer . Naturliga P450s kan utföra flera olika typer av kemiska reaktioner inklusive hydroxyleringar , N,O,S-dealkyleringar , epoxidationer , sulfoxidationer, aryl-arylkopplingar, ringkontraktioner och expansioner, oxidativa cykliseringar, alkohol/aldehydoxidationer, desaturationer , kväveoxidationer, dekarboxyler , nitreringar , såväl som oxidativa och reduktiva dehalogeneringar . Tekniska ansträngningar strävar ofta efter 1) förbättrad stabilitet 2) förbättrad aktivitet 3) förbättrad substratomfattning 4) möjliggjort förmåga att katalysera onaturliga reaktioner. P450-teknik är ett framväxande område inom områdena kemisk biologi och syntetisk organisk kemi ( kemoenzymatisk).

Tillvägagångssätt för att konstruera cytokrom P450-enzymer

Rationell

Rationell enzymteknik kännetecknas av att göra specifika aminosyramutationer baserade på mekanistisk eller strukturell information. Medan P450-enzymer är mekaniskt välkända, är mutationer baserade på strukturell information ofta begränsade av kristalliseringssvårigheter . Även om den höga graden av flexibilitet och plasticitet för aktiva ställen som finns i P450s, när de kan erhållas, gör kristallstrukturer i stort sett föråldrade för rationell design. Ett annat problem uppstår när man försöker utöka substratets omfattning. Detta uppnås ofta genom att öka P450:s aktiva platsstorlek, vilket i sin tur kan resultera i flera substratdockningsorienteringar, vilket resulterar i dålig regio-/stereoselektivitet.

Riktad evolution

Riktad evolution är en enzymteknisk strategi utformad för att efterlikna naturligt urval i laboratoriemiljö. På grund av svårigheten att implementera rationella designstrategier har riktad evolution blivit den valda strategin för P450-teknik. Här kan mutationer introduceras antingen semi-rationellt eller slumpmässigt via site-saturation mutagenes . Den resulterande P450-mutanten (typiskt mutantbibliotek) screenas sedan för önskad aktivitet. Mutanter som uppvisar förbättrade egenskaper vidarebefordras till efterföljande omgångar av mutagenes, och denna cykel upprepas tills den önskade funktionen är tillfredsställande.

P450 tekniska exempel

P450 BM3

P450 BM3 (även känd som CYP102A1) är ett cytokrom P450-enzym isolerat från Bacillus megaterium . BM3 har studerats omfattande i samband med enzymteknik på grund av dess löslighet, hanteringsbara bakteriella isoformer och självförsörjande elektrontransportsystem, men också på grund av dess syntetiska användbarhet. Tekniska studier har avslöjat att BM3-mutanter kan 1) utrustas med nya och differentierade substratomfattningar 2) uppvisa regio-/stereoselektivitet på nya substrat och 3) konstrueras för att vara mycket selektiva och aktiva mot nya substrat. BM3-varianter har varit särskilt användbara för att producera dofter , smakämnen , feromoner och läkemedel . Artemisinsyra (används vid framställningen av den farmaceutiska naturprodukten artemisinin ) framställdes med användning av en BM3-variant som ansvarar för att epoxidera de två alkenerna som finns i amorfa-4,11-dien. Oxidation av valencen till nootkaton (en uppskattad grapefruktsmak) åstadkoms med användning av en F87T- och I263A-mutant (Figur 1).

Figur 1. Oxidation av (+)-valensen med användning av P450 BM3 F87T I263A mutant

Nyligen har Wang et al. rapporterade en BM3 - variant som kan utföra styrenylolefincyklopropanering . Eftersom nativt BM3 uppvisar dålig cyklopropaneringsaktivitet, genomfördes en enzymteknisk ansträngning. I sin kärna är P450 hem-tiolatenzymer som använder molekylärt syre (O 2 ) och NAD(P)H för att utföra syresättningsreaktioner. Som sådan föredrar BM3 att utföra epoxidation i motsats till cyklopropaneringsreaktioner i närvaro av olefiner. Reaktionen mellan etyldiazoacetat (EDA) och 1 valdes som en modellreaktion på grund av den kända svårigheten att epoxidera elektrondefekta olefiner med användning av övergångsmetallkatalys (Figur 2). Denna reaktion genererar förening 2 , som lätt kan omvandlas till levomilnacipran (Fetzima), ett läkemedel som används för att behandla klinisk depression . Till att börja genererades mutanter där den axiella koordinerande cysteinresten i det katalytiska centret ersattes med aminosyrorna serin, alanin, metionin, histidin och tyrosin. Mutanten T268A-axH, som har en axiell histidinligand, katalyserade reaktionen mellan EDA och 1 i 81 % utbyte med 6:94 diastereoselektivitet och 42 % enantioselektivitet. Efterföljande omgångar av site-saturation mutagenes utfördes sedan, vilket resulterade i varianten med namnet BM3-Hstar (innehållande T268A-axH, L437W, V78M och L181V mutationer), som kunde katalysera modellreaktionen med mer än 92% utbyte, 92% enantioselektivitet och 2:98 diastereoselektivitet. Som en extra fördel var BM3-Hstar också kapabel att utföra den önskade cyklopropaneringsreaktionen i närvaro av atmosfäriskt syre (O2) (den enda kända BM3-varianten som kan detta).

Figur 2. Reaktion mellan 1 och etyldiazoacetat (EDA) katalyserad av BM3-Hstar

CYP125

Förutom deras syntetiska användbarhet har P450-enzymer också konstruerats för att bättre förstå deras biokemi. Baserat på den föreslagna katalytiska cykeln, donerar en axiellt ligerad tiolatdel (cystein) elektrontäthet till metallcentret, vilket hjälper till att protonera en ferri-peroxoanjonintermediär (−OO-Fe 3+) som vid vattenförlust genererar ett CH - bindningsreaktivt järn -oxo -arter (O=Fe4 + ). Alternativt, om ferri-peroxo-anjonen förblir oprotonerad, kan denna reaktiva art mediera CC-bindningsklyvning i aldehyd-innehållande substrat (deformylering). För att bättre förstå intermediär dikotomi mellan ferri-peroxo-anjonen och järn-oxo-arterna, konstruerades CYP125 (som är ansvarig för olika metaboliska processer inklusive kolesterolnedbrytning) för att ersätta den axiella ligerade cysteinresten med selenocystein (SeCYP125). I sin tur observerades det att SeCYP125 gynnar bildning av oxiderade produkter jämfört med deformylerade produkter när de reageras med kolesterol-26-aldehyd, vilket indikerar att ökad elektrondonation från selenocystein i förhållande till cystein resulterar i en högre andel järn-oxo i förhållande till järn-peroxoanjon. (Figur 3).

Figur 3. Jämförelse av axiella ligandeffekter på ferri-peroxo-anjonen i CYP125:s katalytiska cykel

Ir(Me)-CYP119-Max

Under 2016 publicerades ett arbete av Dydio et al. rapporterade ett artificiellt metalloenzym som kan katalysera intra-/intermolekylära karben-CH-insättningar i aktiverade/oaktiverade CH-bindningar, med kinetik som den hos ett nativt enzym (Figur 4). Den rapporterade katalysatorn utvecklades genom att byta järn-protoporfyrin-kofaktorn i termostabilt P450-enzym CYP119A1 med en iridium-metyl- protoporfyrin -kofaktor (Ir(Me)-PIX), följt av riktad utveckling. CYP119-Max, en fyrfaldig mutant (C317G, T213G, L69V, V254L), erhölls därefter. Enantiomera överskott (ee) på upp till ±98% erhölls med en fixerad katalysatorbelastning på 0,17 mol%. CYP119-Max kan också genomgå intermolekylära insättningsreaktioner, om än med måttlig ee (68%). För att demonstrera användbarheten av CYP119-Max vid produktion av finkemikalier, producerade en reaktion i 200 mM skala etyl-2,3-dihydrobensofuran-3-karboxylat i 44 % utbyte, med 35 000 omsättningstal (TON) och 93 % ee.

Figur 4. Reaktioner katalyserade av metalloenzym CYP119 Ir(Me)-PIX-CYP119 mutanter