snRNA-sekv

snRNA-seq , även känd som single nucleus RNA-sekvensering , single nuclei RNA-sekvensering eller sNuc-seq , är en RNA-sekvenseringsmetod för profilering av genuttryck i celler som är svåra att isolera, till exempel från vävnader som är arkiverade eller som är hårda att dissocieras. Det är ett alternativ till encells-RNA-seq (scRNA-seq) , eftersom det analyserar kärnor istället för intakta celler.

snRNA-seq minimerar förekomsten av falsk genuttryck, eftersom lokaliseringen av fullt mogna ribosomer till cytoplasman innebär att eventuella mRNA av transkriptionsfaktorer som uttrycks efter dissociationsprocessen inte kan översättas, och därför kan deras nedströmsmål inte transkriberas. Dessutom möjliggör snRNA-seq-teknologi upptäckten av nya celltyper som annars skulle vara svåra att isolera.

Metoder och teknik

Den grundläggande snRNA-seq-metoden kräver fyra huvudsteg: vävnadsbearbetning, kärnisolering, cellsortering och sekvensering. För att isolera och sekvensera RNA inuti kärnan, involverar snRNA-seq användning av ett snabbt och milt nukleärt dissociationsprotokoll. Detta protokoll gör det möjligt att minimera tekniska problem som kan påverka studier, särskilt de som är involverade i omedelbar tidig gen (IEG) beteende.

De resulterande dissocierade cellerna suspenderas och suspensionen lyseras försiktigt, vilket gör att cellkärnorna kan separeras från deras cytoplasmatiska lysat med användning av centrifugering. Dessa separerade kärnor/celler sorteras med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) i individuella brunnar och amplifieras med hjälp av mikrofluidikmaskiner. Sekvensering sker som vanligt och data kan analyseras på lämpligt sätt för dess användning. Denna grundläggande snRNA-seq metodik kan profilera RNA från vävnader som är bevarade eller inte kan dissocieras, men den har inte hög genomströmningskapacitet på grund av dess beroende av kärnsortering med FACS. Denna teknik kan inte lätt skalas till att profilera ett stort antal kärnor eller prover. Massivt parallella scRNA-seq-metoder finns och kan lätt skalas, men deras krav på en enda cellsuspension som input är inte idealiskt och eliminerar en del av den flexibilitet som är tillgänglig med snRNA-seq-metoden när det gäller de typer av vävnader och celler som kan undersökas. Som svar utvecklades DroNc-Seq-metoden med massivt parallell snRNA-seq med droppteknologi av forskare från Broad Institute of MIT och Harvard. I denna teknik är kärnor som har isolerats från sin fixerade eller frusna vävnad inkapslade i droppar med unikt streckkodade pärlor som är belagda med oligonukleotider som innehåller en 30-terminal deoxitymin (dT) sträcka. Denna beläggning fångar det polyadenylerade mRNA-innehållet som produceras när kärnorna lyseras inuti dropparna. Det infångade mRNA:t omvänt transkriberas till cDNA efter emulsionsbrott. Sekvensering av detta cDNA producerar transkriptomerna för alla enstaka kärnor som man tittar på och dessa kan användas för många ändamål, inklusive identifiering av unika celltyper.

Sekvenseringsverktygen och utrustningen som används i scRNA-seq kan användas med modifieringar för snRNA-seq-experiment. Illumina beskriver ett arbetsflöde för den grundläggande snRNA-seq-metoden som kan utföras med befintlig utrustning. DroNc-Seq kan åstadkommas med mikrofluidiska plattformar som är avsedda för Drop-seq scRNA-seq-metoden. Dock har Dolomite Bio anpassat ett av deras instrument, den automatiserade Nadia-plattformen för scRNA-seq, för att användas inbyggt även för DroNc-Seq. Detta instrument skulle kunna förenkla genereringen av enstaka kärnsekvenseringsbibliotek, eftersom det används för sitt avsedda syfte.

När det gäller dataanalys efter sekvensering utvecklades en beräkningspipeline känd som dropSeqPipe av McCarroll Lab vid Harvard. Även om pipelinen ursprungligen utvecklades för användning med Drop-seq scRNA-seq-data, kan den användas med DroNc-Seq-data eftersom den också använder droppteknologi.

Skillnaden mellan snRNA-seq och scRNA-seq

snRNA-seq använder isolerade kärnor istället för hela cellerna för att profilera genuttryck. Det vill säga, scRNA-seq mäter både cytoplasmatiska och nukleära transkript, medan snRNA-seq huvudsakligen mäter nukleära transkript (även om vissa transkript kan vara fästa vid det grova endoplasmatiska retikulumet och delvis bevaras i nukleära preps). Detta gör det möjligt för snRNA-seq att endast bearbeta kärnan och inte hela cellen. Av denna anledning, jämfört med scRNA-seq, är snRNA-Seq mer lämpligt för att profilera genuttryck i celler som är svåra att isolera (t.ex. adipocyter, neuroner), såväl som bevarade vävnader.

Dessutom kan kärnorna som krävs för snRNA-seq erhållas snabbt och enkelt från färska, lätt fixerade eller frusna vävnader, medan isolering av enstaka celler för encellig RNA-seq (scRNA-seq) involverar utökade inkubationer och bearbetning. Detta ger forskare möjligheten att få transkriptom som inte är lika störda under isolering.

Ansökan

Inom neurovetenskap har neuroner en sammankopplad natur som gör det extremt svårt att isolera intakta enstaka neuroner. Eftersom snRNA-seq har dykt upp som en alternativ metod för att bedöma en cells transkriptom genom isolering av enstaka kärnor, har det varit möjligt att genomföra singelneuronstudier från postmortem mänsklig hjärnvävnad. snRNA-seq har också möjliggjort den första singelneuronanalysen av omedelbart tidigt genuttryck (IEG) associerat med minnesbildning i mushippocampus. Under 2019 använde Dmitry et al metoden på kortikal vävnad från ASD-patienter för att identifiera ASD-associerade transkriptomiska förändringar i specifika celltyper, vilket är den första celltypsspecifika transkriptombedömningen i hjärnor som påverkas av ASD.

Utanför neurovetenskapen har snRNA-seq även använts inom andra forskningsområden. Under 2019 jämförde Haojia et al både scRNA-seq och snRNA-seq i en genomisk studie kring njuren. De fann att snRNA-seq uppnår en likvärdig gendetektionshastighet som scRNA-seq i vuxen njure med flera betydande fördelar (inklusive kompatibilitet med frysta prover, minskad dissociationsbias och så vidare). År 2019 använde Joshi et al snRNA-seq i en human lungbiologistudie där de fann att snRNA-seq möjliggjorde opartisk identifiering av celltyper från frusna friska och fibrotiska lungvävnader. Vuxen hjärtvävnad från däggdjur kan vara extremt svår att dissociera utan att skada celler, vilket inte möjliggör enkel sekvensering av vävnaden. Men 2020 presenterade tyska forskare den första rapporten om sekvensering av ett vuxet däggdjurshjärta genom att använda snRNA-seq och kunde tillhandahålla praktiska celltypsfördelningar i hjärtat

För- och nackdelar med snRNA-seq

Fördelar

1. I scRNA-seq kan dissociationsprocessen försämra vissa känsliga celler och vissa celler i vissa vävnader (t.ex. kollagenmatris) kan vara extremt svåra att dissociera. Sådana problem kan förhindras i snRNA-seq eftersom vi bara behöver isolera en enda kärna istället för en hel enskild cell.
2. Till skillnad från scRNA-seq har snRNA-seq snabba och milda kärndissociationsprotokoll som skulle förebygga tekniska problem som uppstår från uppvärmning, proteasnedbrytning.
3. snRNA-seq fungerar mycket bra för konserverade/frysta vävnader.

Nackdelar

1. Sekvensering av RNA i cytoplasman (genisoformer, RNA i mitokondrier och kloroplast etc.) är inte möjlig, eftersom snRNA-seq mestadels mäter nukleära transkript.