Bioteknik inom läkemedelstillverkning

Escherichia coli-bakterier, som ofta används vid tillverkning av farmaceutiska produkter.

Moderna farmaceutiska tillverkningstekniker är ofta beroende av bioteknik .

Humant insulin

Insulinkristaller

Bland de tidigaste användningarna av bioteknik inom läkemedelstillverkning är användningen av rekombinant DNA -teknik för att modifiera Escherichia coli -bakterier för att producera humant insulin , vilket utfördes på Genentech 1978. Före utvecklingen av denna teknik extraherades insulin från bukspottkörteln hos nötkreatur, grisar och andra husdjur. Även om insulin i allmänhet är effektivt vid behandling av diabetes , går det inte att skilja animaliskt insulin från humant insulin och kan därför ge allergiska reaktioner. Genentech-forskare producerade artificiella gener för var och en av de två proteinkedjorna som utgör insulinmolekylen. De artificiella generna "sattes sedan in... i plasmider... bland en grupp gener som" aktiveras av laktos . Således aktiverades även de insulinproducerande generna av laktos. De rekombinanta plasmiderna sattes in i Escherichia coli- bakterier, som "inducerades att producera 100 000 molekyler av antingen kedja A eller kedja B humaninsulin." De två proteinkedjorna kombinerades sedan för att producera insulinmolekyler.

Mänskligt tillväxthormon

Tillväxthormon

Innan användningen av rekombinant DNA-teknik för att modifiera bakterier för att producera mänskligt tillväxthormon , tillverkades hormonet genom extraktion från hypofysen på kadaver, eftersom tillväxthormoner från djur inte har något terapeutiskt värde hos människor. Produktion av ett enda års förråd av mänskligt tillväxthormon krävde upp till femtio hypofyser, vilket skapade betydande brist på hormonet. År 1979 producerade forskare vid Genentech mänskligt tillväxthormon genom att infoga DNA som kodar för mänskligt tillväxthormon i en plasmid som implanterades i Escherichia coli- bakterier. Genen som sattes in i plasmiden skapades genom omvänd transkription av mRNA som finns i hypofysen till komplementärt DNA. HaeIII, en typ av restriktionsenzym som verkar vid restriktionsställen "i den 3' icke-kodande regionen" och vid det 23:e kodonet i komplementärt DNA för humant tillväxthormon, användes för att producera "ett DNA-fragment med 551 baspar som inkluderar kodande sekvenser för aminosyrorna 24–191 i HGH." Sedan producerades "ett kemiskt syntetiserat DNA-'adaptor'-fragment innehållande ett ATG-initieringskodon..." med kodonen för de första till 23:e aminosyrorna i humant tillväxthormon. De "två DNA-fragmenten... [var] kombinerade för att bilda en syntetisk-naturlig "hybrid"-gen." Användningen av helt syntetiska metoder för DNA-produktion för att producera en gen som skulle översättas till humant tillväxthormon i escherichia coli skulle ha varit oerhört mödosamt på grund av den betydande längden av aminosyrasekvensen i humant tillväxthormon. Men om cDNA:t omvänt transkriberat från mRNA för humant tillväxthormon infogades direkt i plasmiden som infogats i escherichia coli, skulle bakterierna översätta regioner av genen som inte translateras i människor och därigenom producera ett "förhormon som innehåller en extra 26 aminosyror" som kan vara svåra att ta bort.

Mänskliga blodkoagulationsfaktorer

Innan utvecklingen och FDA-godkännandet av ett sätt att producera humana blodkoagulationsfaktorer med hjälp av rekombinant DNA-teknik, producerades humana blodkoagulationsfaktorer från donerat blod som var otillräckligt screenat för HIV . Således utgjorde HIV-infektion en betydande fara för patienter med blödarsjuka som fick mänskliga blodkoagulationsfaktorer:

De flesta rapporter indikerar att 60 till 80 procent av patienterna med hemofili som exponerades för faktor VIII-koncentrat mellan 1979 och 1984 är seropositiva för HIV genom Western blot-analysen. I maj 1988 hade mer än 659 patienter med hemofili AIDS...

Den första mänskliga blodkoaguleringsfaktorn som producerades i betydande mängder med hjälp av rekombinant DNA-teknik var Faktor IX , som producerades med hjälp av transgena kinesiska hamsteräggstocksceller 1986. I brist på en karta över det mänskliga genomet fick forskarna en känd sekvens av RNA:t för faktor. IX genom att undersöka aminosyrorna i faktor IX:

Mikrosekvensering av mycket renade ... [Faktor IX] gav tillräcklig aminosyrasekvens för att konstruera oligonukleotidsonder.

Den kända sekvensen av faktor IX RNA användes sedan för att söka efter genen som kodar för faktor IX i ett bibliotek av DNA som finns i den mänskliga levern, eftersom det var känt att blodkoaguleringsfaktorer produceras av den mänskliga levern:

En unik oligonukleotid... homolog med Faktor IX mRNA... syntetiserades och märktes... Den resulterande sonden användes för att screena ett dubbelsträngat cDNA-bibliotek i levern... Kompletta tvåsträngade DNA-sekvenser av... [relevant] cDNA ... innehöll hela den kodande sekvensen COOH-terminal av det elfte kodonet (11) och hela den 3'-otranslaterade sekvensen.

Denna cDNA-sekvens användes för att hitta de återstående DNA-sekvenserna som omfattar faktor IX-genen genom att söka efter DNA i X-kromosomen:

Ett genomiskt bibliotek från en human XXXX-kromosom preparerades... och screenades med en faktor IX cDNA-sond. Hybridiserande rekombinant fag isolerades, plackrenades och DNA:t isolerades. Restriktionskartläggning, Southern-analys och DNA-sekvensering möjliggjorde identifiering av fem rekombinanta fag-innehållande insättningar som, när de överlappade vid vanliga sekvenser, kodade hela 35 kb faktor IX-genen.

Plasmider innehållande faktor IX-genen, tillsammans med plasmider med en gen som kodar för resistens mot metotrexat, sattes in i äggstocksceller från kinesisk hamster via transfektion. Transfektion involverar införande av DNA i en eukaryot cell. Till skillnad från den analoga transformationsprocessen i bakterier, är transfekterat DNA vanligtvis inte integrerat i cellens genom och förs därför vanligtvis inte vidare till efterföljande generationer via celldelning. För att erhålla en "stabil" transfektion måste en gen som ger en betydande överlevnadsfördel också transfekteras, vilket får de få celler som integrerade det transfekterade DNA:t i sina genom att öka sin population som celler som inte integrerade DNA:t. är eliminerade. I fallet med denna studie främjade "tillväxt i ökande koncentrationer av metotrexat" överlevnaden av stabilt transfekterade celler och minskade överlevnaden för andra celler.

De kinesiska hamsteräggstockscellerna som var stabilt transfekterade producerade betydande kvantiteter av faktor IX, som visade sig ha betydande koagulerande egenskaper, men i mindre grad än faktor IX producerad från humant blod:

Den specifika aktiviteten för den rekombinanta faktorn IX mättes på basis av direkt mätning av koagulantaktiviteten... Den specifika aktiviteten för rekombinant faktor IX var 75 enheter/mg... jämfört med 150 enheter/mg uppmätt för plasmahärledd faktor IX...

År 1992 godkände FDA Faktor VIII producerad med hjälp av transgena kinesiska hamsteräggstocksceller, den första sådan blodkoaguleringsfaktor som producerades med rekombinant DNA-teknik som godkändes.

Transgena husdjur

En gris vars transgena generationer kan användas för att producera blodersättningar för användning på människor.

Rekombinanta DNA-tekniker har också använts för att skapa transgena lantbruksdjur som kan producera farmaceutiska produkter för användning på människor. Till exempel har grisar som producerar humant hemoglobin skapats. Även om blod från sådana grisar inte kunde användas direkt för transfusion till människor, kunde hemoglobinet raffineras och användas för att tillverka en blodersättning.

Paklitaxel (Taxol)

Bristol-Myers Squibb tillverkar paklitaxel med Penicillium raistrickii och växtcellsfermentering (PCF). ^{[ citat behövs ]}

Artemisinin

Transgen jäst används för att producera artemisinin , liksom ett antal insulinanaloger .

Se även