Bioreporter

Anatomi av en bioreporterorganism. Vid exponering för en specifik analyt transkriberas promotor/reporter-genkomplexet till budbärar-RNA (mRNA) och översätts sedan till ett reporterprotein som är ytterst ansvarigt för att generera en signal.

Bioreporters är intakta, levande mikrobiella celler som har genmanipulerats för att producera en mätbar signal som svar på en specifik kemisk eller fysikalisk agent i deras miljö . Bioreporters innehåller två väsentliga genetiska element, en promotorgen och en reportergen . Promotorgenen slås på ( transkriberas ) när målmedlet finns i cellens miljö. Promotorgenen i en normal bakteriecell är kopplad till andra gener som sedan på samma sätt transkriberas och sedan översätts till proteiner som hjälper cellen att antingen bekämpa eller anpassa sig till medlet som den har exponerats för. I fallet med en bioreporter har dessa gener, eller delar därav, tagits bort och ersatts med en reportergen. Följaktligen gör att promotorgenen slås på nu att reportergenen slås på. Aktivering av reportergenen leder till produktion av reporterproteiner som i slutändan genererar någon typ av detekterbar signal. Därför indikerar närvaron av en signal att bioreportern har känt av ett speciellt målagent i sin miljö.

Ursprungligen utvecklad för grundläggande analys av faktorer som påverkar genuttryck , användes biorapportörer tidigt för att detektera miljöföroreningar och har sedan dess utvecklats till områden som är så olika som medicinsk diagnostik , precisionsjordbruk , livsmedelssäkerhet , processövervakning och kontroll och biomikroelektronisk datoranvändning. Deras mångsidighet härrör från det faktum att det finns ett stort antal reportergensystem som är kapabla att generera en mängd olika signaler. Dessutom kan reportergener sättas in genetiskt i bakterie- , jäst- , växt- och däggdjursceller och därigenom tillhandahålla avsevärd funktionalitet över ett brett spektrum av värdvektorer.

Reportergensystem

Flera typer av reportergener finns tillgängliga för användning i konstruktionen av bioreporterorganismer, och signalerna som de genererar kan vanligtvis kategoriseras som antingen kolorimetriska , fluorescerande , luminescerande , kemiluminescerande eller elektrokemiska . Även om var och en fungerar olika, förblir deras slutprodukt alltid densamma – en mätbar signal som är proportionell mot koncentrationen av det unika kemiska eller fysikaliska ämne som de har exponerats för. I vissa fall uppstår signalen endast när ett sekundärt substrat läggs till bioanalysen ( luxAB , Luc och aequorin). För andra bioreportörer måste signalen aktiveras av en extern ljuskälla (GFP och UMT), och för ett fåtal utvalda bioreporterare är signalen helt självinducerad, utan att något exogent substrat eller extern aktivering krävs (luxCDABE ) . Följande avsnitt beskriver i korthet några av de tillgängliga reportergensystemen och deras befintliga tillämpningar.

Bakteriellt luciferas (Lux)

Bioluminescens som emitteras från kolonier av mikrobiella celler som innehåller generna för bakteriellt luciferas.

Luciferas är ett generiskt namn för ett enzym som katalyserar en ljusemitterande reaktion. Luciferaser kan hittas i bakterier, alger, svampar, maneter, insekter, räkor och bläckfisk, och det resulterande ljuset som dessa organismer producerar kallas bioluminescens. I bakterier har generna som är ansvariga för den ljusemitterande reaktionen ( lux -generna) isolerats och använts i stor utsträckning i konstruktionen av bioreportrar som avger ett blågrönt ljus med maximal intensitet vid 490 nm. Tre varianter av lux finns tillgängliga, en som fungerar vid < 30°C, en annan vid < 37°C och en tredje vid < 45°C. Det lux består av fem gener, luxA , luxB , luxC , luxD , och luxE . Beroende på kombinationen av dessa gener som används kan flera olika typer av bioluminescerande bioreportrar konstrueras.

luxAB Bioreporters

luxAB bioreportrar innehåller endast generna luxA och luxB , som tillsammans är ansvariga för att generera ljussignalen. För att fullständigt fullborda den ljusemitterande reaktionen måste emellertid ett substrat tillföras cellen. Vanligtvis sker detta genom tillsats av den kemiska dekanalen någon gång under bioanalysproceduren. Många luxAB- bioreportrar har konstruerats inom bakterie-, jäst-, insekts-, nematod-, växt- och däggdjurscellsystem.

luxCDABE Bioreporters

Istället för att bara innehålla luxA- och luxB -generna, kan bioreportrar innehålla alla fem generna i luxkassetten , vilket möjliggör ett helt oberoende ljusgenererande system som inte kräver några främmande tillsatser av substrat eller någon excitation av en extern ljuskälla. Så i denna bioanalys exponeras bioreportern helt enkelt för en målanalyt och en kvantitativ ökning av bioluminescens resulterar, ofta inom mindre än en timme. På grund av deras snabbhet och lätthet att använda, tillsammans med förmågan att utföra bioanalysen repetitivt i realtid och online, gör luxCDABE bioreporters extremt attraktiva. Följaktligen har de införlivats i en mångfald av detektionsmetoder som sträcker sig från avkänning av miljöföroreningar till realtidsövervakning av patogeninfektioner hos levande möss.

Ospecifika lux Bioreporters

Ospecifika lux- bioreporterare används vanligtvis för att detektera kemiska toxiner. De är vanligtvis utformade för att kontinuerligt bioluminescera. Vid exponering för ett kemiskt toxin dör antingen cellen eller så försenas dess metaboliska aktivitet, vilket leder till en minskning av självlysande ljus. Deras mest välbekanta tillämpning är i Microtox [1] -analysen där, efter en kort exponering för flera koncentrationer av provet, den minskade bioluminescensen kan korreleras med relativa nivåer av toxicitet .

Firefly luciferas (Luc)

Firefly luciferas katalyserar en reaktion som producerar synligt ljus i intervallet 550 – 575 nm. Ett klickbaggeluciferas finns också som producerar ljus vid en topp närmare 595 nm. Båda luciferaserna kräver tillsats av ett exogent substrat (luciferin) för att ljusreaktionen ska inträffa. Många luc -baserade bioreportrar har konstruerats för detektering av ett brett spektrum av oorganiska och organiska föreningar av miljöhänsyn. De mest lovande tillämpningarna är dock förmodligen beroende av att introducera eldflugans luciferas genetiska kod i andra eukaryota celler och vävnader.

Medicinsk diagnostik

Insättning av luc -generna i en human cervikal karcinomcellinje ( HeLa ) illustrerade att tumörcellsclearance kunde visualiseras i en levande mus genom att helt enkelt skanna med en laddningskopplad enhetskamera , vilket gör det möjligt för kemoterapibehandling att snabbt övervakas online och i realtid. I ett annat exempel luc -generna i humana bröstcancercellinjer för att utveckla en bioanalys för detektion och mätning av substanser med potentiell östrogen och antiöstrogen aktivitet.

Forskning om genreglering

Särskilda promotorer kan placeras uppströms om luc- genen, det vill säga luc- sekvensen kan fusioneras till promotorsekvensen på DNA-nivå. Om en sådan konstruktion inte är för stor i storlek kan den helt enkelt introduceras i eukaryota celler med användning av plasmider . Detta tillvägagångssätt används i stor utsträckning för att studera aktiviteten hos en given promotor i en given cell/vävnadstyp, eftersom mängden ljus som produceras av luciferaset är direkt proportionell mot promotoraktiviteten. Förutom att studera promotorerna, erbjuder eldflugeluciferasanalyser möjligheten att studera transkriptionella aktivatorer : i dessa experiment används vanligtvis GAL4/UAS_systemet och dess Gal4 uppströms aktiverande DNA-sekvens (UAS) placeras uppströms luc -genen medan de olika aktivatorerna eller olika varianter/fragment av samma aktivator fuseras till GAL4 DNA-bindningsmodulen på proteinnivå. På så sätt kan transkriptionsaktiviteten hos de olika GAL4-fusionsproteinerna direkt jämföras med ljus som avläsning.

Aequorin

Aequorin är ett fotoprotein isolerat från den självlysande maneten Aequorea victoria . Vid tillsats av kalciumjoner (Ca2+) och coelenterazin uppstår en reaktion vars slutresultat är generering av blått ljus i området 460 - 470 nm. Aequorin har inkorporerats i humana B-cellinjer för detektion av patogena bakterier och virus i vad som kallas Cell CANARY- analysen (Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields). B-cellerna är genetiskt modifierade för att producera aequorin. Vid exponering för antigener från olika patogener avger de rekombinanta B-cellerna ljus som ett resultat av aktivering av en intracellulär signalkaskad som frisätter kalciumjoner inuti cellen.

Grönt fluorescerande protein (GFP)

Grönt fluorescerande protein (GFP) är också ett fotoprotein som isolerats och klonas från maneten Aequorea victoria . Varianter har också isolerats från havspensen Renilla reniformis . GFP, som aequorin, producerar en blå fluorescerande signal, men utan den erforderliga tillsatsen av ett exogent substrat. Allt som krävs är en ultraviolett ljuskälla för att aktivera fotoproteinets fluorescerande egenskaper. Denna förmåga att autofluorescera gör GFP mycket önskvärt i biosensing-analyser eftersom det kan användas online och för att övervaka intakta, levande celler. Dessutom gör möjligheten att ändra GFP för att producera ljusemissioner förutom blått (dvs. cyan, rött och gult) att den kan användas som en multianalytdetektor. Följaktligen har GFP använts i stor utsträckning i bioreporterkonstruktioner inom bakterie-, jäst-, nematod-, växt- och däggdjursvärdar.

Uroporfyrinogen (urogen) III metyltransferas (UMT)

Uroporfyrinogen (urogen) III metyltransferas (UMT) katalyserar en reaktion som ger två fluorescerande produkter som producerar en röd-orange fluorescens i intervallet 590 - 770 nm när de belyses med ultraviolett ljus . Så som med GFP krävs ingen tillsats av exogena substrat. UMT har använts som en bioreporter för val av rekombinanta plasmider , som en markör för gentranskription i bakterie-, jäst- och däggdjursceller, och för detektion av giftiga salter som arsenit och antimonit .