Analytisk ultracentrifugering

Analytisk ultracentrifugering är en analytisk teknik som kombinerar en ultracentrifug med optiska övervakningssystem.

Spinco Model E analytisk ultracentrifug. Detta är ett tidigt instrument med anor från 1950-talet. Operatören sitter framför provkammaren, med sin vänstra hand vidrör rotorn. Under drift skulle kammaren tätas bakom ett pansarhölje och pumpas ner till vakuum. Höljet har sänkts för att tillåta åtkomst för lastning eller lossning av rotorn.

I en analytisk ultracentrifug (vanligtvis förkortad AUC) övervakas ett provs sedimentationsprofil i realtid av ett optiskt detektionssystem. Provet detekteras via ultraviolett ljus absorption och/eller interferens optiskt brytningsindex känsligt system, övervakat av ljuskänslig diod array eller av film i de äldre maskinerna. Operatören kan således observera förändringen av provkoncentrationen mot rotationsprofilens axel med tiden som ett resultat av det applicerade centrifugalfältet. Med modern instrumentering digitaliseras dessa observationer elektroniskt och lagras för vidare matematisk analys.

makromolekylernas bruttoform, konformationsförändringar i makromolekyler och storleksfördelningar av makromolekyler. Med AUC är det möjligt att få information om antalet och subenhetsstökiometrin för icke- kovalenta komplex och jämviktskonstanter för makromolekyler såsom proteiner , DNA , nanopartiklar eller andra sammansättningar från olika molekylklasser. Det enklaste måttet som kan erhållas är sedimenteringskoefficienten , som beror på storleken på molekylerna som sedimenteras. Detta är förhållandet mellan en partikels sedimentationshastighet och den applicerade accelerationen som orsakar sedimenteringen.

Analytisk ultracentrifugering har nyligen sett en ökad användning på grund av ökad lätthet att analysera med moderna datorer och utveckling av mjukvara, inklusive ett National Institutes of Health- stödt programpaket, SedFit.

Historia

Instrumentation

Rotorer för en analytisk ultracentrifug för en maximal rotationshastighet på 50 000 (vänster) och 60 000 (höger) rpm

En analytisk ultracentrifug har en ljuskälla och optiska detektorer. För att ljuset ska kunna passera genom analyten under ultracentrifugeringskörningen krävs specialiserade celler som måste uppfylla höga optiska standarder samt motstå centrifugalkrafterna. Varje cell består av ett hus, två fönster gjorda av optiskt rent kvartsglas och en mittdel med en eller två sektorer och påfyllningshål för sektorn/sektorerna, stängda med en skruvplugg i huset. Dessa celler placeras i en rotorkavitet med ett kontinuerligt hål, med en krage i botten för att hålla kvar cellen.

Teori

Typer av experiment

Genom att tillämpa specifik utrustning och anpassa mätparametrar kan flera typer av experiment utföras. De vanligaste AUC-experimenten är sedimentationshastighet och sedimentationsjämviktsexperiment.

Sedimentationshastighet

Sedimentationshastighetsexperiment visar analyternas form och molära massa, såväl som deras storleksfördelning. Storleksupplösningen för denna metod skalar ungefär med kvadraten på partikelradierna, och genom att justera rotorhastigheten för experimentet kan storleksintervall från 100 Da till 10 GDa täckas. Sedimentationshastighetsexperiment kan också användas för att studera reversibla kemiska jämvikter mellan makromolekylära arter, genom att antingen övervaka antalet och molära massan av makromolekylära komplex, genom att få information om den komplexa sammansättningen från multisignalanalys som utnyttjar skillnader i varje komponents spektroskopiska signal, eller genom att efter sammansättningsberoendet av sedimentationshastigheterna för det makromolekylära systemet, som beskrivs i Gilbert-Jenkins teori.

Experimentet syftar till att övervaka sedimentationsbeteendet vid en fast vinkelhastighet.

Sedimentationsjämvikt

Sedimentationsjämviktsexperiment rapporterar molmassan av analyter och deras kemiska jämviktskonstanter . Rotorhastigheten justeras så att en stabil koncentrationsprofil c(r) av provet i cellen bildas, där sedimentation och diffusion tar ut varandra.

Densitetsgradientcentrifugering

Datautvärdering

Se även

externa länkar

Vidare läsning

Lebowitz J, Lewis MS, Schuck P (januari 2005). "Modern analytisk ultracentrifugering i proteinvetenskap: En handledningsgranskning" . Proteinvetenskap . 102 (9): 2067–2069. doi : 10.1110/ps.0207702 . PMC 2373601 . PMID 12192063 .
Balbo A, Minor KH, Velikovsky CA, Mariuzza RA, Peterson CB, Schuck P (Jan 2005). "Studera multiproteinkomplex genom multisignalsedimentationshastighet analytisk ultracentrifugering" . PNAS . 102 (1): 81–86. Bibcode : 2005PNAS..102...81B . doi : 10.1073/pnas.0408399102 . PMC 538923 . PMID 15613487 .
Cole J, Hansen J (dec 1999). "Analytisk ultracentrifugering som ett modernt biomolekylärt forskningsverktyg" . J Biomol Tech . 10 (4): 163–76. PMC 2291609 . PMID 19499023 .