Tetracyklinkontrollerad transkriptionsaktivering

Exempel på ett T-REx-system som kontrollerar uttrycket av shRNA

Tetracyklinkontrollerad transkriptionell aktivering är en metod för inducerbar genuttryck där transkription slås på eller av reversibelt i närvaro av antibiotikumet tetracyklin eller ett av dess derivat (t.ex. doxycyklin ).

Tetracyklinkontrollerat genuttryck är baserat på mekanismen för resistens mot tetracyklinantibiotisk behandling som finns i gramnegativa bakterier . I naturen uttrycker P _tet -promotorn TetR, repressorn , och TetA, proteinet som pumpar ut tetracyklinantibiotikum ur cellen.

Skillnaden mellan Tet-On och Tet-Off är inte om transaktivatorn slår på eller av en gen, som namnet kan antyda; snarare aktiverar båda proteinerna uttryck. Skillnaden hänför sig till deras respektive svar på tetracyklin eller doxycyklin (Dox, en mer stabil tetracyklinanalog); Tet-Off aktiverar uttryck i frånvaro av Dox, medan Tet-On aktiveras i närvaro av Dox.

Tet-Off och Tet-On

De två mest använda inducerbara expressionssystemen för forskning av eukaryot cellbiologi heter Tet-Off och Tet-On. Tet-Off-systemet för att kontrollera uttrycket av gener av intresse i däggdjursceller utvecklades av professorerna Hermann Bujard [ de ] och Manfred Gossen vid universitetet i Heidelberg och publicerades först 1992.

Tet-Off-systemet använder sig av proteinet tetracyklintransaktivator (tTA) , som skapas genom att fusionera ett protein , TetR (tetracyklinrepressor), som finns i Escherichia coli- bakterier, med aktiveringsdomänen för ett annat protein, VP16 , som finns i herpes . simplex virus .

Det resulterande tTA-proteinet kan binda till DNA vid specifika TetO- operatorsekvenser . I de flesta Tet-Off-system placeras flera upprepningar av sådana TetO-sekvenser uppströms om en minimal promotor såsom CMV-promotorn. Helheten av flera TetO-sekvenser med en minimal promotor kallas ett tetracyklinresponselement (TRE), eftersom det svarar på bindning av tetracyklintransaktivatorproteinet tTA genom ökat uttryck av genen eller generna nedströms om dess promotor.

I ett Tet-Off-system kan uttryck av TRE-kontrollerade gener undertryckas av tetracyklin och dess derivat. De binder tTA och gör det oförmöget att binda till TRE-sekvenser, vilket förhindrar transaktivering av TRE-kontrollerade gener.

Ett Tet-On-system fungerar på liknande sätt, men på motsatt sätt. Medan tTA i ett Tet-Off-system kan binda operatören endast om det inte är bundet till tetracyklin eller ett av dess derivat, såsom doxycyklin, i ett Tet-On-system, kan rtTA-proteinet binda operatören endast om det är bundet av en tetracyklin. Sålunda initierar introduktionen av doxycyklin till systemet transkriptionen av den genetiska produkten. Tet-On-systemet föredras ibland framför Tet-Off för dess snabbare respons.

Tet-Off- expressionssystem används också för att generera transgena möss som villkorligt uttrycker en intressant gen.

Tet-On Advanced och Tet-On 3G

Tet-On Advanced-transaktivatorn (även känd som rtTA2 ^S -M2) är en alternativ version av Tet-On som uppvisar reducerat basalt uttryck och fungerar med en 10 gånger lägre Dox-koncentration än Tet-Off. Dessutom anses dess uttryck vara mer stabilt i eukaryota celler på grund av att det är humant kodonoptimerat och använder tre minimala transkriptionsaktiveringsdomäner. Den upptäcktes 2000 som en av två förbättrade mutanter av H. Bujard och hans kollegor efter slumpmässig mutagenes av Tet-repressordelen av transaktivatorgenen. Tet-On 3G (även känd som rtTA-V10) liknar Tet-On Advanced men härleddes från rtTA2 ^S -S2 snarare än rtTA2 ^S -M2. Det är också humant kodonoptimerat och består av tre minimala VP16-aktiveringsdomäner. Tet-On 3G-proteinet har dock fem aminosyraskillnader jämfört med Tet-On Advanced som verkar öka dess känslighet för Dox ytterligare. Tet-On 3G är känslig för 100 gånger mindre Dox och är sju gånger mer aktiv än original Tet-On.

Andra system

Andra system som T-REx-systemet från Life Technologies fungerar på ett annat sätt. Genen av intresse flankeras av en uppströms CMV-promotor och två TetO2-ställen. Uttryck av genen av intresse undertrycks av den höga affinitetsbindningen av TetR-homodimerer till varje TetO2-sekvens i frånvaro av tetracyklin. Införande av tetracyklin resulterar i bindning av en tetracyklin på varje TetR-homodimer följt av frisättning av TetO2 av TetR-homodimererna. Avbindning av TetR-homodimerer och TetO2 resulterar i depression av genen av intresse.

syntetiska biologiska kretsen Linearizer , optimerad för inställning av genuttryck i eukaryota (knoppande jäst, mänskliga, etc) celler. Genom att införliva TetO2-ställen i promotorn som driver TetR-uttrycket skapar det negativ feedback , vilket säkerställer homogent uttryck (lågt brus) och ett linjärt dossvar på tetracyklinanaloger.

Tetracyklinresponselement (TRE)

I de mest använda plasmiderna består tetracyklinresponselementet av sju upprepningar av den 19 bp bakteriella TetO-sekvensen (TCCCTATCAGTGATAGAGA) separerade av spacersekvenser (till exempel: ACGATGTCGAGTTTAC). Det är TetO som känns igen och bundet av TetR-delen av Tet-On eller Tet-Off. TRE placeras vanligtvis uppströms om en minimal promotor som har mycket lågt basalt uttryck i frånvaro av bundet Tet-Off (eller Tet-On).

Fördelar och nackdelar

Tet-systemet har fördelar jämfört med Cre , FRT och ER (östrogenreceptor) betingade genuttryckssystem. I Cre- och FRT-systemen är aktivering eller knockout av genen irreversibel när rekombination väl har uppnåtts, medan den i Tet- och ER-system är reversibel. Tet-systemet har mycket snäv kontroll på uttrycket, medan ER-systemet är något läckande. Tet-systemet, som är beroende av transkription och efterföljande translation av en målgen, är dock inte lika snabbverkande som ER-systemet, vilket stabiliserar det redan uttryckta målproteinet vid hormonadministrering. Dessutom, eftersom 19 bp tet-o-sekvensen är naturligt frånvarande från däggdjursceller, pleiotropi vara minimerad jämfört med hormonella metoder för kontroll. När Tet-systemet används i cellodling är det viktigt att bekräfta att varje sats av fetalt bovint serum testas för att bekräfta att kontaminerande tetracykliner saknas eller är för låga för att störa inducerbarheten.

Verkningsmekanismen för den antibakteriella effekten av tetracykliner är beroende av att störa proteintranslation i bakterier och därigenom skada mikrobers förmåga att växa och reparera; men proteintranslation störs också i eukaryota mitokondrier , vilket leder till effekter som kan förvirra experimentella resultat.

Se även

externa länkar