Teknik för mångfaldsmatriser

Diversity Arrays Technology (DArT) är en genetisk markörteknik med hög genomströmning som kan upptäcka alleliska variationer för att ge omfattande genomtäckning utan DNA-sekvensinformation för genotypning och annan genetisk analys. De allmänna stegen involverar att reducera komplexiteten hos det genomiska DNA : t med specifika restriktionsenzymer , välja olika fragment för att fungera som representationer för modergenomen, amplifiera via polymeraskedjereaktion (PCR), infoga fragment i en vektor som ska placeras som prober i en mikroarray fluorescerande mål från en referenssekvens kommer att tillåtas hybridisera med sönder och föras genom ett avbildningssystem. Målet är att identifiera och kvantifiera olika former av DNA-polymorfism inom genomiskt DNA från provtagna arter.

Först rapporterades 2001 av Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein och Kaiman Peng, DART prioriterade betydande fördelar framför andra traditionella primerbaserade metoder som förmågan att analysera stora mängder olika prover från en låg mängd initialt DNA. Det gav också låga kostnader och snabbare resultat jämfört med relaterade DNA-matriser i fast tillstånd som upptäckte Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Sedan starten har teknologin varit ett viktigt instrument i analysen av polyploida växter såväl som i konstruktionen av fysiska och genetiska kartor för att förstå relaterade till arter baserat på likheter och alleliska variationer mellan deras genom.

Historia

Konceptet utvecklades först av Damian Jaccoud, Andrzej Kilian, David Feinstein och Kaiman Peng 2001. De syftade till att etablera en genomisk DNA-polymorfism detektion och kvantifieringsteknik som ökar genomströmningen jämfört med mer traditionella metoder som Amplified Fragment Length Polymorphism ( AFLP ) ), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Simple Sequence Repeats (SSR). De syftade också till att minimera kostnaden och beroendet av sekvenserade genom för att identifiera polymorfismer, vilket är en konsekvens av tidiga immobiliserade, fasta DNA-matriser, som DNA-chips , som enbart identifierar SNP. En biprodukt av deras upptäckt av en snabb, billig helgenomprofileringsmetod var att den också gav identifiering av SNP såväl som basparinsättningar, -deletioner och -skiftningar, vilket är ett extra lager av allelisk variation mellan arter analyseras.

Jaccoud, Kilian, Feinstein och Peng valde nio underarter av ris som deras källa för genomisk DNA och polymorfismanalys. Analysen bestod av att detektera närvaron eller frånvaron av specifika DNA-polymorfismer med sonderingsmatriser samt kvantifiera styrkan av varje signal, via fluorescens, inom underarten. Efter selektering och extrahering av DNA-prover från försökspersoner, digererades prover med tre specifika restriktionsenzymer och ligerades med T4-ligas. Efter ligering i dubbelsträngat DNA utfördes spädning såväl som extraktion av en kort mängd blandning för användning som en PCR-mall. Produkter placerades i en pCR2.1-TOPO-vektor och transformerades därefter till E. coli , som valdes baserat på resistens mot ampicillin och pigmentering från X-gal- interaktionen. Klonade celler amplifieras med PCR-amplifieras, renas och introduceras i en mikroarray. Referens-DNA och prover blandades med fluorescerande färgämnen, Cy3 eller Cy5, blandades, denaturerades och fick hybridisera för att ytterligare återinföra dem i mikroarrayen för vidare analys. Resultaten rapporterade att användningen av DArT kunde detektera närvaron eller frånvaron av polymorfism på ett ändamålsenligt sätt jämfört med RFLP samt kvantifiera de upptäckta polymorfismerna. Dessutom kunde DArT minimera mängden initialt DNA som krävs för att utföra analysen avsevärt jämfört med andra metoder.

Procedur

DarT är uppdelat i tre väsentliga steg: Komplexitetsreduktion, genomisk representation och DarT-analys.

Reduktion av komplexitet

Detta steg i processen handlar om att reducera stort komplext genomiskt DNA från utvalda arter till fler hanterbara fragmenterade komponenter genom användning av specifika restriktionsenzymer. Dessutom förlitar sig detta steg uteslutande på matsmältningsenzymer över ett par försök med matsmältningsenzymer och primers på grund av den rapporterade ökade polymorfismen som identifierats över analyserade prover. PstI . - enzymet är ett vanligt använt restriktionsenzym för detta steg på grund av dess specificitet för arternas icke-repetitiva, icke-metylerade genom

Genomisk representation

När genomiskt DNA har reducerats till en hanterbar storlek från föregående steg genom att införliva ett eller två specifika restriktionsenzymer, involverar nästa steg att selektera för de fragment som innehåller den största mängden signifikant polymorfism över genpoolen . Dessa utvalda fragment kallas "representationer" eftersom de är mindre representationer av det initiala, större genomiska DNA:t. Det är eminent att undvika repetitiva sekvenser när man väljer fragment eftersom dessa kommer att uppvisa den lägsta mängden polymorfism inom analyserat genomiskt DNA.

DART-analys

Digererade sekvenser ligeras med användning av T4-ligas för att producera dubbelsträngat DNA. En liten mängd ligerad blandning kommer att spädas ut och sedan amplifieras via PCR. Under PCR är det viktigt att använda primrar som är komplementära till restriktionsenzymens skärställen och RedTaq-polymeras, som sällan hämmas. Blanda produkten till en amplifierad genpoolrepresentation och ligera till vektorn pCR2.1-TOPO. Efter representation infogning i vektor, transformera vektor till E . coli-celler via elektriska stötar eller kemiska medel. Inkubera celler och välj baserat på ampicillinresistens och vitpigmentering från inaktiv β-galaktosidasgen i ett medium innehållande X-gal. Inserts amplifieras sedan via PCR och sätts in som spotters i ett mikroarray-objektglas. Objektglasen centrifugeras för att isolera insatser, som sedan renas.

Fluorescerande färgämnen, Cy3 eller Cy5, läggs till mikroarray-målen, som är genomiska representationer. Efter tillsats av det fluorescerande färgämnet läggs mål till mikroarraysonder som innehåller den amplifierade E. coli-kloner där denaturering och efterföljande hybridisering, om möjligt, äger rum. Efter hybridisering tvättas objektglasen och skannas med ett bildsystem som riktar sig mot fluorescerande signaler med inkorporering av en öppen källkodsprogramvara som heter DArTsoft. Interaktioner och olikheter mellan sond och olika mål används för att utveckla ett histogram som kvantifierar och identifierar flera former av DNA-polymorfism bland analyserade genom.

Ansökningar

Molekylär avel

Förmågan att identifiera och kvantifiera alleliska variationer mellan genom utan behov av ett sekvenserat genom är av stort värde för DArT och har stora implikationer i den molekylära avelssektorn. Genom att jämföra grödor med fenotyper som högre avkastning av produkter eller resistens mot vissa miljöparasiter, kan en fenotyp kopplas direkt till en DNA-polymorfism som identifieras bland besläktade arter genom DarT. DArT kan också överträffa andra genotypningstekniker med polyploider på grund av frånvaron av primerkonkurrens som finns i andra tekniker. Polyploider finns vanligtvis bland jordbruksmässigt viktiga grödor. DArT har till exempel använts för att genomföra genomomfattande analys bland Musa- arter, vilket inkluderar bananer och bananer, vilket ledde till utvecklingen av ett fylogenetiskt kladogram baserat på genetiska markörer härledda från DArT-tekniker. Denna utveckling förbättrar avelskunskapen för att få önskvärda avkastningar och produkter.

Snabb igenkänning av markörer som hittats med gener som är ansvariga för fenotyper studeras också hos djur med hjälp av DArT. Myggas resistens mot insekticider har kopplats till specifika mutationer i gener som ger resistens mot vissa arter av myggor framför andra. Genotypiska variationer hittades genom markörer medan DArT-analys utfördes på relevanta prover.

Genomisk kartläggning

Eftersom DArT kan hitta genetiska relationer mellan arter inom ett metagenom på ett billigt och snabbt sätt, har det varit en integrerad del av utvecklingen av fysiska och genetiska kartor över närbesläktade arter. I starten användes DArT för att utveckla fylogenetiska kladogram av risunderarter baserat på närvaron eller frånvaron av DNA-fragment i varje arts genom. På samma sätt inkorporerades DArT i tillverkningen av genetiska kartor för A. thaliana genom att utföra en automatiserad version av DArT. Vete, en hexaploid, är också en annan gröda som har dragit nytta av implementeringen av en DarT-analys eftersom en bakteriell artificiell kromosom (BAC) av den största kromosomen, 3B, skapades från markörer som upptäckts genom DarT-analyser.