Stabil nukleinsyralipidpartikel
Stabila nukleinsyralipidpartiklar ( SNALP ) är mikroskopiska partiklar med en diameter på cirka 120 nanometer , mindre än våglängderna för synligt ljus. De har använts för att leverera siRNA terapeutiskt till däggdjur in vivo . I SNALPs omges siRNA av ett lipiddubbelskikt innehållande en blandning av katjoniska och fusogena lipider, belagda med diffuserbar polyetylenglykol .
Introduktion
RNA-interferens (RNAi) är en process som sker naturligt i cytoplasman och hämmar genuttryck vid specifika sekvenser. Reglering av genuttryck genom RNAi är möjlig genom att introducera små interfererande RNA (siRNA), som effektivt tystar uttryck av en riktad gen. RNAi aktiverar det RNA-inducerade tystnadskomplexet (RISC) som innehåller siRNA, siRNA som härrör från klyvt dsRNA. siRNA:t styr RISC-komplexet till en specifik sekvens på mRNA:t som klyvs av RISC och, följaktligen, tystar dessa gener.
Men utan modifieringar av RNA-ryggraden eller inkludering av inverterade baser i någon ände gör siRNA-instabilitet i plasma det extremt svårt att tillämpa denna teknik in vivo . Mönsterigenkänningsreceptorer (PRR), som kan grupperas som endocytiska PRR eller signalerande PRR, uttrycks i alla celler i det medfödda immunsystemet . Signalerande PRR inkluderar i synnerhet Toll-like receptors (TLRs) och är främst involverade i att identifiera patogenassocierade molekylära mönster (PAMPs). TLR:er kan till exempel känna igen specifika regioner som är konserverade i olika patogener, igenkännande som stimulerar ett immunsvar med potentiellt förödande effekter på organismen. I synnerhet TLR 3 igen både dsRNA som är karakteristiskt för viral replikation och siRNA, som också är dubbelsträngat. Utöver denna instabilitet rör en annan begränsning av siRNA-terapi oförmågan att rikta in sig på en vävnad med någon specificitet.
SNALP kan dock ge den stabilitet och specificitet som krävs för att detta sätt av RNAi-terapi ska vara effektivt. SNALPs består av ett lipiddubbelskikt och kan ge stabilitet till siRNA genom att skydda dem från nukleaser i plasman som skulle bryta ned dem. Dessutom är leverans av siRNA föremål för endosomal trafficking, vilket potentiellt exponerar dem för TLR3 och TLR7 , och kan leda till aktivering av interferoner och proinflammatoriska cytokiner . SNALPs tillåter emellertid siRNA-upptag i endosomen utan att aktivera Toll-liknande receptorer och följaktligen stimulera ett hämmande immunsvar, vilket gör det möjligt för siRNA att fly från endosomen.
Utveckling av SNALP-leverans av siRNA
Nedreglering av genuttryck via siRNA har varit ett viktigt forskningsverktyg i in vitro -studier. Mottaglighet hos siRNA för nukleasnedbrytning gör dock användningen av dem in vivo problematisk. År 2005 fastställde forskare som arbetade med hepatit B-virus (HBV) hos gnagare att vissa modifieringar av siRNA förhindrade nedbrytning av nukleaser i plasman och ledde till ökad gentystnad jämfört med omodifierat siRNA. Modifieringar av sens- och antisenssträngarna gjordes på olika sätt. Med avseende på både sense- och antisenssträngar ersattes 2'-OH med 2'-fluoro vid alla pyrimidinpositioner . Dessutom modifierades senssträngar vid alla purinpositioner med deoxiribos, antisenssträngar modifierades med 2'- O -metyl i samma positioner. 5'- och 3'-ändarna av sense-strängen täcktes med abasiska inverterade upprepningar, medan en fosfortioatbindning inkorporerades vid 3'-änden av antisenssträngen.
Även om denna forskning visade en potentiell RNAi-terapi med modifierat siRNA, berodde minskningen på 90 % av HBV-DNA hos gnagare från en dos på 30 mg/kg med frekvent administrering. Eftersom detta inte är en livskraftig doseringsregim, tittade samma grupp på effekterna av att inkapsla siRNA i ett PEGylerat lipiddubbelskikt, eller SNALP. Specifikt underlättar lipiddubbelskiktet upptag in i cellen och efterföljande frisättning från endosomen, det PEGylerade yttre skiktet ger stabilitet under formuleringen på grund av den resulterande hydrofiliciteten hos det yttre. Enligt denna studie från 2005 erhöll forskare 90 % minskning av HBV-DNA med en dos på 3 mg/kg/dag av siRNA under tre dagar, en dos som var betydligt lägre än den tidigare studien. Dessutom, i motsats till omodifierad eller modifierad och icke-inkapslad siRNA, resulterade administrering av SNALP-levererat siRNA i inga detekterbara nivåer av interferoner , såsom IFN-a, eller inflammatoriska cytokiner associerade med immunstimulering. Trots det erkände forskare att mer arbete var nödvändigt för att nå en genomförbar dos och doseringsregim.
Under 2006 uppnådde forskare som arbetade med tystnad av apolipoprotein B (ApoB) hos icke-mänskliga primater 90 % tystnad med en engångsdos på 2,5 mg/kg av SNALP-levererat APOB-specifikt siRNA. ApoB är ett protein involverat i sammansättningen och utsöndringen av mycket lågdensitetslipoprotein (VLDL) och lågdensitetslipoprotein (LDL), och det uttrycks främst i levern och jejunum . Både VLDL och LDL är viktiga för kolesteroltransport och dess metabolism. Inte bara observerades denna grad av tystnad mycket snabbt, cirka 24 timmar efter administrering, utan tystnadseffekterna bibehölls i över 22 dagar efter endast en enda dos. Forskare testade också en engångsdos på 1 mg/kg och erhöll en tystnad på 68 % av målgenen, vilket tyder på dosberoende tystnad. Denna dosberoende tystnad var uppenbar inte bara på graden av tystnad utan varaktigheten av tystnaden, uttryck av målgenen som återhämtade sig 72 timmar efter administrering.
Även om SNALPs med en diameter på 100 nm har använts effektivt för att rikta in sig på specifika gener för tystnad, finns det en mängd olika systemiska barriärer som relaterar specifikt till storlek. Till exempel hindras diffusion in i solida tumörer av stora SNALPs och på liknande sätt gör inflammerade celler med förbättrad permeation och retention det svårt för stora SNALPs att komma in. Dessutom kräver retikuloendotelial eliminering, blod-hjärnbarriärstorleksselektivitet och begränsningar av kapillärfenestrae en mindre SNALP för att effektivt kunna leverera målspecifikt siRNA. Under 2012 utvecklade forskare i Tyskland vad de kallade "mono-NALPs" med hjälp av en ganska enkel lösningsmedelsutbytesmetod som involverade progressiv utspädning av en 50% isopropanollösning. Resultatet är ett mycket stabilt leveranssystem som liknar traditionella SNALP, men ett som bara har en diameter på 30 nm. De mono-NALP som utvecklats här är emellertid inaktiva, men kan bli aktiva bärare genom att implementera specifika mål- och frisättningsmekanismer som används av liknande leveranssystem.
Ansökningar
Zaire Ebola-virus (ZEBOV)
Vi kunde ge fullständigt skydd med antingen en pool av siRNA inkapslade i SNALP eller individuella SNALP siRNA, beroende på deras relativa styrka ... [det mest potenta siRNA] ... gav absolut skydd, det vill säga 100 procent överlevnad, och även bidrog till fullständig aviremi hos de infekterade marsvinen. Så det fanns inget påvisbart ebolavirus även om djuren hade inokulerats med i huvudsak 30 000 gånger den dödliga smittsamma dosen för viruset.
— Thomas Geisbert, USAMRIID , maj 2006
I maj 2010 skapade en applicering av SNALP på Ebola Zaire-viruset rubriker, eftersom preparatet kunde bota rhesusmakaker när det administrerades kort efter att de exponerats för en dödlig dos av viruset, som kan vara upp till 90 % dödlig för människor i sporadiska utbrott i Afrika. Behandlingen som användes för rhesusmakaker bestod av tre siRNA (förskjutna duplex av RNA) som riktade in sig på tre virala gener. SNALP:erna (omkring 81 nm i storlek här) formulerades genom spontan vesikulering från en blandning av kolesterol , di palmitoylfosfatidylkolin , 3-N-[(ω-metoxipoly(etylenglykol)2000)karbamoyl]-1,2-dimyrestyloxipropylamin , och katjonisk 1,2-dilinoleyloxi-3-N,N-dimetylaminopropan.
Utöver appliceringen av rhesusmakak har SNALPs också visat sig skydda cavia porcellua från viremi och död när de administreras kort efter exponering för ZEBOV. Ett polymeras (L) gen-specifikt siRNA-leveranssystem påtvingades fyra gener associerade med det virala genomiska RNA:t i ribonukleoproteinkomplexet som finns i EBOV-partiklar (varav tre matchar applikationen ovan): NP, VP30, VP35 och L-proteinet . SNALPs varierade från 71 till 84 nm i storlek och var sammansatta av syntetiskt kolesterol, fosfolipid DSPC, PEG lipid PEGC-DMA och katjonisk lipid DLinDMA i molförhållandet 48:20:2:30. Resultaten bekräftar fullständigt skydd mot viremi och död hos marsvin när de administreras med ett SNALP-siRNA-tillförselsystem efter diagnos av ebolaviruset, vilket bevisar att denna teknologi är en effektiv behandling. Framtida studier kommer främst att fokusera på att utvärdera effekterna av siRNA "cocktails" på EBOV gener för att öka antivirala effekter.
Hepatocellulärt karcinom
År 2010 utvecklade forskare en tillämplig målterapi för hepatocellulärt karcinom (HCC) hos människor. Identifieringen av CSN5, den femte subenheten av COP9-signalosomkomplexet som hittades i tidig HCC, användes som ett terapeutiskt mål för siRNA-induktion. Systemisk leverans av modifierat CSN5siRNA inkapslat i SNALPs hämmade signifikant levertumörtillväxt i Huh7-luc+ ortotopisk xenograftmodell av human levercancer. SiRNA-medierad CSN5-knockdown visade sig också hämma cellcykelprogression och ökar apoptoshastigheten i HCC-celler in vitro. Inte bara visar dessa resultat rollen av CSN5 i levercancerprogression, de indikerar också att CSN5 har en viktig roll i HCC-patogenes. Sammanfattningsvis har SNALP:er visat sig avsevärt minska tillväxten av hepatocellulärt karcinomtumör i humana Huh7-luc*-celler genom terapeutisk tystnad.
Tumörer
Under 2009 utvecklade forskare siRNA som kan rikta in sig på både polo-liknande kinas 1 ( PLK1 ) och kinesin spindelprotein (KSP). Båda proteinerna är viktiga för tumörcellers cellcykel, PLK1 involverad i fosforylering av en mängd olika proteiner och KSP integrerad i kromosomsegregering under mitos . Specifikt kan bipolära mitotiska spindlar inte bildas när KSP hämmas, vilket leder till stopp av cellcykeln och, så småningom, apoptos . På samma sätt underlättar hämning av PLK1 mitotiska arresteringar och cellapoptos. Enligt studien resulterade en 2 mg/kg dos av PLK1-specifik siRNA administrerad i 3 veckor till möss implanterade med tumörer i ökade överlevnadstider och uppenbar minskning av tumörer. I själva verket var medianöverlevnadstiden för behandlade möss 51 dagar i motsats till 32 dagar för kontrollerna. Vidare hade endast 2 av de 6 mössen som behandlades märkbara tumörer runt implantationsstället. Trots detta GAPDH , en tumörhärledd signal, närvarande vid låga nivåer, vilket tyder på betydande undertryckande av tumörtillväxt men inte fullständig eliminering. Ändå antydde resultaten minimal toxicitet och ingen signifikant dysfunktion i benmärgen. Djur behandlade med KSP-specifik siRNA uppvisade också ökade överlevnadstider på 28 dagar jämfört med 20 dagar i kontrollerna.