Selektion och amplifieringsbindningsanalys

Selektions- och amplifieringsbindningsanalys (SAAB) är en molekylärbiologisk teknik som vanligtvis används för att hitta DNA- bindningsstället för proteiner . Den utvecklades av T. Keith Blackwell och Harold M. Weintraub 1990.

Metod

SAABs experimentella procedur består av flera steg, beroende på tillgänglig kunskap om bindningsstället. En typisk SAAB består av följande steg:

1. Syntes av mall med slumpmässig sekvens i bindningsställe: tre situationer är möjliga: (i) när både bindningsstället och proteinet är kända och tillgängliga; (ii) när endast ett konsensusbindningsställe är tillgängligt och bindningsproteinet inte är det; och (iii) när proteinet är tillgängligt, men bindningsstället är okänt. När bindningsstället inte är känt måste antalet slumpmässiga nukleotidpositioner i mallen vara stort.
2. Inkubera märkt dubbelsträngad mall med protein: vanligtvis måste proteinet syntetiseras i en värdcell med fusionstekniker. Längre inkubationstid och stor mängd tillhandahålls vid ett ospecifikt bindningsställe.
3. Isolera det DNA-bundna proteinet med EMSA: det DNA-bundna proteinet, migrerat i akrylamidgel, isoleras genom autoradiografi enligt ett EMSA-protokoll ( Electrophoretic Mobility Shift Assay) .
4. Amplifiera den bundna mallen med PCR. För positiv kontroll, amplifiera också startmallen; Det bundna DNA:t isoleras via gelexcision, renas och amplifieras med PCR.
5. Märk amplifierat bindningsställe och välj om för bindning med EMSA. Föregå bindningssteget minst 5 gånger med det amplifierade märkta DNA-provet och fusionsproteinet.
6. Sekvensera DNA :t: Efter det sista steget av selektion och elektrofores, klona DNA:t till en kloningsvektor och sekvensera det. Ursprungligen använde Blackwell Pyro-sekvensering, som kan ersättas av moderna tekniker.

Ansökningar

Quox homeodomän

Quox1 är en homeobox -gen involverad i regleringen av utvecklingsmönster ( morfogenes ) hos djur, svampar och växter och isolerades ursprungligen från cDNA-biblioteket av fem veckors vaktembryon . Det är den enda genen i hox-familjen som har visat sig uttrycka i både prosencephalon och mesencephalon involverad i differentieringen av de centrala och perifera nervcellerna. Det optimala DNA-bindningsstället för Quox1 eller dess däggdjurshomologer identifierades av SAAB 2004. Det amplifierade Quox1 DNA-fragmentet erhållet från PCR-amplifiering från ett humant embryo cDNA-bibliotek digererades med EcoRV och XhoI och klonades in i Smal- och Xhol-restriktionsstället för uttrycket vektor pGEMEXxBal. De rekombinanta plasmiderna transformerades till kompetent Escherichia coli-stam BL21 och Quox1-fusionsproteiner isolerades genom kromatografiska tekniker.

Den radiomärkta sonden inkuberades med 25 pmol renat Quox1 homeodomänfusionsprotein i bindningsbuffert för EMSA. Det proteinbundna DNA:t detekterades genom autoradiografi, och banden som representerade protein-DNA-komplex skars ut från gelén och det eluerade DNA:t amplifierades med PCR med användning av primrar som är komplementära till de 20 bp icke-slumpmässiga flankerande sekvenserna. Efter 5 uppsättningar av samma procedur klonades det renade DNA:t in i pMD 18T och sekvenserades. Slutligen identifierades sekvensen CAATC som konsensusbindningssekvensen för Quox1 homeodomän.

Undersökning

Genom att kombinera kraften i slumpmässigt sekvensval med poolad sekvensering möjliggör SAAB imprint-analysen samtidig screening av ett stort antal bindningsställesmutanter. SAAB tillåter också identifiering av platser med hög relativ bindningsaffinitet eftersom konkurrensen är inneboende i protokollet. Det kan också identifiera platspositioner som är neutrala eller specifika baser som kan störa bindning, såsom en T vid -4 i E47-halvplatsen. Vi kan tillämpa tekniken på mindre affinitetsbindande sekvens också, förutsatt att hålla hög koncentration av bindande protein vid varje bindningssteg. Det är också möjligt att identifiera bindningsstället även om både proteinet och sekvensen inte är kända.

Vidare läsning

•    Amendt BA, Sutherland LB, Russo AF (1999). "Multifunktionell roll för Pitx2 homeodomänproteinet C-terminal svans" . Molekylär och cellulär biologi . 19 (10): 7001–10. doi : 10.1128/MCB.19.10.7001 . PMC 84695 . PMID 10490637 .