Platsstyrd spin-märkning
Platsstyrd spin-märkning ( SDSL) är en teknik för att undersöka strukturen och den lokala dynamiken hos proteiner med hjälp av elektronspinresonans . Teorin om SDSL är baserad på den specifika reaktionen av spin-etiketter med aminosyror . En spin-etiketts inbyggda proteinstruktur kan detekteras med EPR- spektroskopi. SDSL är också ett användbart verktyg vid undersökningar av proteinveckningsprocessen .
Spinnmärkning
Platsstyrd spin-märkning (SDSL) var banbrytande i laboratoriet av Dr. WL Hubbell . I SDSL introduceras ställen för vidhäftning av spin-märkningar i rekombinant uttryckta proteiner genom platsriktad mutagenes . Funktionella grupper som ingår i spinnetiketten bestämmer deras specificitet. Vid neutralt pH reagerar proteintiolgrupper specifikt med de funktionella grupperna metanetiosulfonat, maleimid och jodacetamid, vilket skapar en kovalent bindning med aminosyran Cys . Spin-etiketter är en unik molekylär reporter, eftersom de är paramagnetiska (innehåller en oparad elektron). HM McConnells laboratorium 1965. Sedan dess har en mängd olika nitroxidspin- etiketter haft stor användning för studier av makromolekylär struktur och dynamik på grund av deras stabilitet och enkla EPR -signal. Nitroxylradikalen (NO) är vanligtvis inkorporerad i en heterocyklisk ring (t.ex. pyrrolidin ), och den oparade elektronen är övervägande lokaliserad till NO-bindningen. När den väl har införlivats i proteinet, dikteras en spin-etiketts rörelser av dess lokala miljö. Eftersom spin-etiketter är utsökt känsliga för rörelse, har detta djupgående effekter på dess EPR-spektrum.
Sammansättningen av membranproteinkomplex med flera underenheter har också studerats med användning av spin-märkning. Bindningen av PsaC-subenheten till PsaA- och PsaB-subenheterna i det fotosyntetiska reaktionscentret, Photosystem I, har analyserats i stor detalj med denna teknik.
Dr. Ralf Langens grupp visade att SDSL med EPR (University of Southern California, Los Angeles) kan användas för att förstå strukturen hos amyloidfibriller och strukturen av membranbundet protein alfa-synuklein från Parkinsons sjukdom. En studie från 2012 genererade en högupplöst struktur av IAPP-fibriller med en kombination av SDSL, puls EPR och beräkningsbiologi.