Peptidspektralbibliotek
Ett peptidspektralbibliotek är en kurerad, kommenterad och icke-redundant samling/databas av LC-MS/MS-peptidspektra. En väsentlig användning av ett peptidspektralbibliotek är att fungera som konsensusmallar som stödjer identifieringen av peptider/proteiner baserat på korrelationen mellan mallarna med experimentella spektra. [ citat behövs ]
En potentiell tillämpning av peptidspektrala bibliotek är identifieringen av nya, för närvarande okända masspektra. Här jämförs spektra från biblioteket med de nya spektra och om en matchning hittas kan de okända spektra tilldelas identiteten för den kända peptiden i biblioteket.
Spektralbibliotek har använts för identifiering av små molekylers masspektra sedan 1980-talet. Under de första åren av hagelgevärsproteomik antydde pionjärundersökningar att ett liknande tillvägagångssätt kan vara tillämpligt inom hagelgevärsproteomik för identifiering av peptid/protein.
Hagelgevärs proteomik
Moderna tandem MS-instrument kombinerar egenskaper med snabb arbetscykel, utsökt känslighet och oöverträffad massnoggrannhet. Tandemmasspektrometri , som är en idealisk matchning för storskalig proteinidentifiering och kvantifiering i komplexa biologiska system. I en shotgun proteomics -metod smälts proteiner i en komplex blandning av proteolytiska enzymer som trypsin. Därefter appliceras en eller flera kromatografiska separationer för att lösa upp resulterande peptider, som sedan joniseras och analyseras i en masspektrometer . För att förvärva tandemmasspektra, isoleras en speciell peptidprekursor och fragmenteras i en masspektrometer ; masspektra som motsvarar fragmenten av peptidprekursor registreras. Tandemmasspektra innehåller specifik information om sekvensen av peptidprekursorn, vilket kan underlätta identifieringen av peptid/protein.
Proteinidentifiering via sekvensdatabassökning
Sekvensdatabassökning används för närvarande i stor utsträckning för masspektrabaserad proteinidentifiering. I detta tillvägagångssätt används en proteinsekvensdatabas för att beräkna alla förmodade peptidkandidater i den givna miljön (proteolytiska enzymer, felklyvningar, post-translationella modifieringar). Sekvenssökmotorerna använder olika heuristik för att förutsäga fragmenteringsmönstret för varje peptidkandidat. Sådana derivatmönster används som mallar för att hitta en tillräckligt nära matchning inom experimentella masspektra, vilket fungerar som bas för peptid/proteinidentifiering. Många verktyg har utvecklats för denna praxis, som har möjliggjort många tidigare upptäckter, t.ex. SEQUEST, Mascot.
Brister i arbetsflödet för sökning av sekvensdatabaser
På grund av den komplexa naturen av peptidfragmentering i en masspektrometer , kommer derivatfragmenteringsmönster inte att reproducera experimentella masspektra, särskilt relativa intensiteter bland distinkta fragment. [ citat behövs ] Således står sekvensdatabassökning inför en flaskhals med begränsad specificitet. Sekvensdatabassökning kräver också ett stort sökutrymme, som fortfarande inte kunde täcka alla möjligheter för peptiddynamik, vilket uppvisar begränsad effektivitet efter translationella modifieringar ). Sökprocessen är ibland långsam och kräver dyra högpresterande datorer. Dessutom kopplar karaktären av sekvensdatabassökning bort forskningsupptäckten mellan olika grupper eller vid olika tidpunkter.
Fördelar och begränsningar
För det första kommer ett kraftigt reducerat sökutrymme att minska söktiden. För det andra, genom att dra full nytta av alla spektrala egenskaper inklusive relativa fragmentintensiteter, neutrala förluster från fragment och olika ytterligare specifika fragment, kommer processen för spektrasökning att bli mer specifik, och den kommer i allmänhet att ge bättre åtskillnad mellan sanna och falska matchningar. [ citat behövs ]
Spektralbibliotekssökning är inte tillämpbar i en situation där upptäckten av nya peptider eller proteiner är målet. Lyckligtvis förvärvas fler och fler högkvalitativa masspektra av det kollektiva bidraget från det vetenskapliga samfundet, som kontinuerligt kommer att utöka täckningen av peptidspektrala bibliotek.
Forskningssamhället fokuserade peptidspektrala bibliotek
För ett peptidspektrabibliotek är att nå en maximal täckning ett långsiktigt mål, även med stöd från forskarsamhället och ständigt växande proteomteknologi. [ citat behövs ] Emellertid är optimeringen för en viss modul i peptidspektrabiblioteket ett mer hanterbart mål, t.ex. proteinerna i en viss organell eller relevant för en viss biologisk fenotyp. Till exempel kommer en forskare som studerar mitokondriella proteomer sannolikt att fokusera sina analyser inom proteinmoduler i mitokondrierna . Forskningssamfundets fokuserade peptidspektralbibliotek stödjer riktad forskning på ett heltäckande sätt för en viss forskargemenskap. [ citat behövs ]