pBR322
pBR322 är en plasmid och var en av de första allmänt använda E. coli - kloningsvektorerna . Skapad 1977 i Herbert Boyers laboratorium vid University of California , San Francisco , fick den sitt namn efter Francisco Bolivar Zapata , postdoktorn och Raymond L. Rodriguez . P står för "plasmid" och BR för "Bolivar" och "Rodriguez".
pBR322 är 4361 baspar i längd och har två antibiotikaresistensgener – genen bla som kodar för ampicillinresistensproteinet ( Amp R ) och genen tetA som kodar för tetracyklinresistensproteinet (Tet R ) . Den innehåller replikationsursprunget för pMB1 och rop -genen, som kodar för en restriktor med plasmidkopienummer. Plasmiden har unika restriktionsställen för mer än fyrtio restriktionsenzymer . Elva av dessa fyrtio platser ligger inom Tet R -genen. Det finns två ställen för restriktionsenzymer Hindlll och Clal inom promotorn för Tet R -genen. Det finns sex nyckelrestriktionsställen inuti Amp R -genen. Källan till dessa antibiotikaresistensgener är från pSC101 för tetracyklin och RSF2124 för ampicillin.
Den cirkulära sekvensen är numrerad så att 0 är mitten av det unika EcoRI- stället och antalet ökar genom Tet R -genen. Om vi till exempel måste ta bort ampicillin måste vi använda restriktionsendonukleas eller molekylär sax mot PstI och då kommer pBR322 att bli anti-resistent mot ampicillin. Samma process för insättningsinaktivering kan tillämpas på tetracyklin. Amp R -genen är penicillin beta-laktamas . Promotorerna P1 och P3 är för beta-laktamasgenen. P3 är den naturliga promotorn och P1 skapas artificiellt genom ligering av två olika DNA-fragment för att skapa pBR322. P2 är i samma region som P1, men det är på den motsatta strängen och initierar transkription i riktning mot tetracyklinresistensgenen.
Bakgrund
Tidiga kloningsexperiment kan utföras med användning av naturliga plasmider såsom ColEl och pSC101 . Var och en av dessa plasmider kan ha sina fördelar och nackdelar. Till exempel ColE1 -plasmiden och dess derivat fördelen av högre kopietal och möjliggör kloramfenikolamplifiering av plasmiden för att producera ett högt utbyte av plasmid, men screening för immunitet mot colicin El är inte tekniskt enkelt. Plasmiden pSC101, en naturlig plasmid från Salmonella panama , ger tetracyklinresistens vilket möjliggör en enklare screeningprocess med antibiotikaselektion, men det är en plasmid med lågt antal kopior som inte ger ett högt utbyte av plasmid. En annan plasmid, RSF 2124, som är ett derivat av ColE1, ger ampicillinresistens men är större.
Många andra plasmider konstruerades på konstgjord väg för att skapa en som skulle vara idealisk för kloningsändamål, och pBR322 visade sig vara mest mångsidig av många och var därför den mest populära. Den har två antibiotikaresistensgener, som selekterbara markörer , och ett antal bekväma unika restriktionsställen som gjorde den lämplig som en kloningsvektor . Plasmiden konstruerades med genetiskt material från 3 huvudkällor - tetracyklinresistensgenen av pSC101, ampicillinresistensgenen av RSF 2124 och replikationselementen av pMB1, en nära släkting till ColE1- plasmiden.
Ett stort antal andra plasmider baserade på pBR322 har sedan dess konstruerats specifikt utformade för en mängd olika ändamål. Exempel inkluderar pUC- serien av plasmider. De flesta expressionsvektorer för extrakromosomalt proteinuttryck och skyttelvektorer innehåller pBR322-replikationsursprunget, och fragment av pBR322 är mycket populära vid konstruktionen av intraspecies skyttel- eller binära vektorer och vektorer för målinriktad integration och excision av DNA från kromosom.
DNA-sekvens
Sekvensen i pBR322 är
pBR322 1 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 61 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 121 ctggttatg 121 caggggtg actgc cgggcctctt 181 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 241 tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctgtcg ccctg ccctg ccct tgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 361 cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 421 aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 481 cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccgggggg 541 actgtccgggggg 541 actgtccgggggg attc tgc tcaacggcct 601 caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 661 gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tcttat gctt gctt gctt gctt gctt caactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 781 ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 841 tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 901 acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt 961 cttgcttggggat attc tc ttctcgcttc 1021 cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca 1081 tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcgacc tcgatt4 ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat 1201 tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg 1261 ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga 1321 attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac 1381 atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcaccg 1 cgcaccg4 ggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg 1501 ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc 1561 tgctgcaaacga ctga ct ccgtgtttcg 1621 taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca 1681 ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga 1741 ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa 1801 cgttccagta accgggcatg ttcatca gtcgtct1 catcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc 1921 aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt 1981 ctggagaaac tcaacgagcagct ggacgacg at 2catggaggg 1 gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 2101 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 2161 agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 2221 cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact gggcttaacta 8 ccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 2341 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 2401 ggcgagccatcaggc tcaggggata 2461 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 2521 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 2581 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 2641 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggat 1ccg0 agcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 2761 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2821 ccttatccgg taactgtaccct cggta cggta cggg cggg cggcg cggcgcg 1 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 2941 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3001 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3061 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aagatgatt1 aagagatt2 ggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3181 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 3241 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 3 aggttatcatgatcttatcatcttatcttatcttatcatgaaaaaaa ctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 3361 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 3421 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 3481 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 3541 attgttgccaccaggtagttaggtagtag gttg 3601 ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 3661 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaaa gcggttag1 cctcctga 3gttaggg gc agtgtatca ctcatggtta 3781 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 3841 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 3901 cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 3961 gaaaacgttcga aggatga tt ccagttcga 4021 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 4081 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaact1 catttgaat 4081 ggtgagcaaa g ggttattgtc 4201 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 4261 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 4321 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga a |
|---|