Omvänd komplementpolymeraskedjereaktion

Omvänd komplementpolymeraskedjereaktion (RC-PCR) är en modifiering av polymeraskedjereaktionen ( PCR). Det används främst för att generera amplikonbibliotek för DNA- sekvensering genom nästa generations sekvensering (NGS). Tekniken tillåter både amplifieringen och förmågan att bifoga sekvenser eller funktionella domäner oberoende av varandra till endera änden av de genererade amplikonerna i en enda sluten rörreaktion. RC-PCR uppfanns 2013 av Daniel Ward och Christopher Mattocks vid Salisbury NHS Foundation Trust, Storbritannien.

Principer

Representation av interaktionen mellan den universella primern och RC-proben för att generera funktionell målspecifik primer. Universal primer hybridiserar till RC-proben och förlängs av DNA-polymeraset som genererar målspecifik primer . 5-primerdelen av RC-proben innehåller den omvända komplementsekvensen för den önskade målspecifika primersekvensen.

I RC-PCR finns inga målspecifika primrar i reaktionsblandningen. Istället bildas målspecifika primrar allteftersom reaktionen fortskrider. En typisk reaktion som använder metoden kräver fyra oligonukleotider . Oligonukleotiderna interagerar med varandra i par; en oligonukleotidsond och en universell primer (innehåller valfria funktionella domäner), som hybridiserar med varandra vid sina 3'-ändar. När den väl hybridiserats kan den universella primern förlängas, med användning av oligonukleotidproben som mall, för att ge fullt formade, målspecifika primrar, som sedan är tillgängliga för att amplifiera mallen i efterföljande omgångar av termisk cykling enligt en standard PCR-reaktion.

Oligonukleotidproben kan också blockeras vid 3'-änden vilket förhindrar ekvivalent förlängning av proben, men detta är inte väsentligt. Sonden är inte förbrukad; den är tillgänglig för att fungera som en mall för den universella primern som ska "konverteras" till målspecifik primer under på varandra följande PCR-cykler. Denna generering av målspecifik primer sker parallellt med standard PCR-amplifiering under standard PCR-förhållanden.

Representation av en typisk multiplex RC-PCR för generering av amplikonbibliotek för nedströmsanalys genom Illumina nästa generations sekvensering. Flera mål amplifieras och dubbelindexeras i en enda sluten rörreaktion. Målspecifik primergenerering sker i den första och efterföljande omgångarna med målamplifiering och amplikongenerering som sker i den andra och efterföljande omgångarna av termisk cykling.

Fördelar

Diagrammatisk representation av relativa reaktionskomponenter av en RC-PCR-reaktion jämfört med en standard PCR- reaktion.

RC-PCR ger betydande fördelar jämfört med andra metoder för amplikonbibliotek framställningsmetoder. Det viktigaste är att det är en reaktion med enstaka slutna rör, detta eliminerar korskontaminering associerad med andra tvåstegs PCR-metoder samt använder mindre reagens och kräver mindre arbete att utföra.

Tekniken ger också den betydande fördelen med flexibiliteten att lägga till vilken önskad sekvens eller funktionell domän som helst till endera änden av vilken amplikon som helst. Detta är för närvarande mest fördelaktigt i moderna nästa generations sekvenseringslaboratorier (NGS) där ett enda målspecifikt sondpar kan användas med ett helt bibliotek av universella primrar. Denna fördel används med NGS-applikationer för att applicera provspecifika index oberoende på varje ände av amplikonkonstruktionen. Ett laboratorium som använder detta tillvägagångssätt skulle bara kräva en enda uppsättning indexprimrar, som kan användas med alla målspecifika prober som är kompatibla med den indexuppsättningen. Detta minskar signifikant antalet och längden av oligonukleotider som krävs av laboratoriet jämfört med att använda fullängds försyntetiserade indexerade målspecifika primrar.

Genereringen av den målspecifika primern i reaktionen när den fortskrider leder också till mer balanserade reaktionskomponenter. Koncentrationer av målspecifik primer är mer i linje med målmolekylkoncentrationen, vilket minskar potentialen för både off-target primer och primerdimerisering.

Variationer

• Multiplex RC-PCR – där två eller flera universella primer- probuppsättningar finns i reaktionsblandningen för att amplifiera två eller flera mål samtidigt.
• RT-RC-PCR – Denna modifiering används när mallmaterialet som tillhandahålls i reaktionen är RNA snarare än DNA . I denna modifiering innehåller reaktionsblandningen även omvänt transkriptasenzymer och omvänd transkriptionsprimrar såväl som de universella primrarna och omvända komplementsonderna enligt metoden. Detta tillvägagångssätt tillåter omvänd transkription av den tillhandahållna RNA- mallen, bildandet av tailed target-specifika primers och amplifiering av de önskade målen i en enda sluten rörreaktion.
• Enkeländad RC-PCR – Denna variant av metoden används när endast ett komplementärt universellt primerprobpar tillhandahålls i reaktionen för att generera en målspecifik primer. Den andra målspecifika primern tillhandahålls som en traditionell primer enligt standard PCR .

Historia

Efter uppfinningen av RC-PCR 2013 validerades tekniken kliniskt och användes diagnostiskt för en rad ärftliga sjukdomar som hemokromatos och trombofili såväl som somatiskt förvärvade sjukdomar inklusive myeloproliferativa neoplasmer och akut myeloisk leukemi i Wessex Regional Genetics Laboratory (WRGL ), Salisbury Storbritannien. På senare tid har arbete genomförts för att använda tekniken i kampen mot SARS-CoV-2-pandemin.

Patentansökan lämnades in i Storbritannien 2015 och beviljades 2020. Patentansökningar har lämnats in i andra jurisdiktioner över hela världen och är för närvarande under behandling .

I maj 2019 licensierades den immateriella egendomen till Nimagen BV för att utveckla, tillverka och marknadsföra kit som utnyttjar tekniken. För närvarande kommersiellt tillgängliga kit som använder tekniken inkluderar de för mänsklig identifiering och på senare tid för hela genomsekvenseringen av SARS-CoV-2- viruset för variantidentifiering, spårning och behandlingssvar. I augusti 2022 lanserade Nimagen officiellt en rad produkter som använder RC-PCR-teknologin för mänskliga kriminaltekniska tillämpningar under varumärket IDseek®.

externa länkar

• RC-PCR-animation
• WIPO patentansökningsinformationssida