Nukleinsyratest
Ett nukleinsyratest ( NAT ) är en teknik som används för att detektera en viss nukleinsyrasekvens och därmed vanligtvis för att detektera och identifiera en viss art eller underart av organism, ofta ett virus eller en bakterie som fungerar som en patogen i blod , vävnad , urin , etc. NAT:er skiljer sig från andra tester genom att de upptäcker genetiskt material ( RNA eller DNA ) snarare än antigener eller antikroppar . Detektering av genetiskt material möjliggör en tidig diagnos av en sjukdom eftersom upptäckten av antigener och/eller antikroppar kräver tid för att de ska börja dyka upp i blodomloppet. Eftersom mängden av ett visst genetiskt material vanligtvis är mycket liten, innehåller många NAT:er ett steg som förstärker det genetiska materialet - det vill säga gör många kopior av det. Sådana NAT kallas nukleinsyraamplifieringstest ( NAAT ). Det finns flera sätt att amplifiera, inklusive polymeraskedjereaktion (PCR), strängförskjutningsanalys (SDA) eller transkriptionsmedierad analys (TMA).
Praktiskt taget alla nukleinsyraamplifieringsmetoder och detektionsteknologier använder specificiteten för Watson-Crick basparning ; enkelsträngade sond- eller primermolekyler fångar DNA- eller RNA -målmolekyler av komplementära strängar . Därför är utformningen av probsträngar mycket betydelsefull för att höja känsligheten och specificiteten för detektionen. Mutanterna som utgör den genetiska basen för en mängd olika mänskliga sjukdomar skiljer sig dock vanligtvis något från de normala nukleinsyrorna. Ofta är de bara olika i en enda bas, t.ex. insertioner , deletioner och enkelnukleotidpolymorfismer (SNP). I det här fallet kan ofullständig sond-målbindning lätt uppstå, vilket resulterar i falskt positiva utfall som att man missar en stam som är kommensal för en som är patogen. Mycket forskning har ägnats åt att uppnå singelbasspecificitet.
Framsteg
Nukleinsyra (DNA och RNA) strängar med motsvarande sekvenser håller ihop i parvisa kedjor, blixtlås som kardborre i en torktumlare. Men varje nod i kedjan är inte särskilt klibbig, så den dubbelsträngade kedjan kommer kontinuerligt halvvägs upplåst och drar ihop sig igen under påverkan av omgivande vibrationer (kallas termiskt brus eller Brownsk rörelse ) . Längre parningar är mer stabila. Nukleinsyratester använder en "sond" som är en lång sträng med en kort sträng fast vid den. Den långa primersträngen har en motsvarande (komplementär) sekvens till en "mål"-sträng från den sjukdomsorganism som detekteras. Sjukdomssträngen klibbar tätt till den exponerade delen av den långa primersträngen (kallad "tåhåll") och förskjuter sedan lite i taget den korta "beskyddar"-strängen från sonden. I slutändan är den korta skyddssträngen inte bunden till någonting, och den obundna korta primern är detekterbar. Resten av det här avsnittet ger lite historik över den forskning som behövs för att finjustera denna process till ett användbart test.
2012 publicerade Yins forskargrupp en artikel om att optimera specificiteten för nukleinsyrahybridisering. De introducerade en "tåhållsutbytesprob (PC)" som består av en förhybridiserad komplementsträng C och en skyddssträng P. Komplementsträngen är längre än skyddssträngen för att ha obunden svans i slutet, ett tåhåll. Komplement är perfekt komplementärt med målsekvensen. När rätt mål(X) reagerar med tåhållsutbytesproben(PC), frisätts P och hybridiserad produkt XC bildas. Reaktionens standardfria energi (∆) är nära noll. Å andra sidan, om tåhållsutbytesproben (PC) reagerar med falska mål(S), går reaktionen framåt, men standardenergin ökar till att vara mindre termodynamiskt gynnsam. Standardskillnaden för fri energi (∆∆) är tillräckligt betydande för att ge uppenbar diskriminering i utbyte. Diskrimineringsfaktorn Q beräknas som utbytet av korrekt målhybridisering dividerat med utbytet av falsk målhybridisering. Genom experimenten på olika tåhållsutbytessonder med 5 korrekta mål och 55 falska mål med energiskt representativa enkelbasförändringar (ersättningar, deletioner och insättningar), drog Yins grupp slutsatsen att diskrimineringsfaktorerna för dessa sonder var mellan 3 och 100 + med medianen 26. Proberna fungerar robust från 10 °C till 37 °C, från 1 mM till 47 mM och med nukleinsyrakoncentrationer från 1 nM till 5 M. De kom också på att tåhållsutbytesproberna fungerar robust även vid RNA-detektion.
Ytterligare forskning har studerats därefter. 2013 publicerade Seeligs grupp en artikel om fluorescerande molekylära prober som också använder tåhållsutbytesreaktionen. Detta möjliggjorde optisk detektering av korrekt mål och SNP-mål. De lyckades också detektera SNP i E. coli-härledda prover.
Under 2015 uppnådde Davids grupp extremt hög (1 000+) selektivitet av singelnukleotidvarianter (SNV) genom att introducera systemet som kallas "kompetitiva kompositioner". I detta system konstruerade de en kinetisk reaktionsmodell av de underliggande hybridiseringsprocesserna för att förutsäga de optimala parametervärdena, som varierar baserat på sekvenserna av SNV och vildtyp (WT), på designarkitekturen för sonden och sänkan och på reagenset koncentrationer och analysförhållanden. Deras modell lyckades med en median 890-faldig selektivitet för 44 cancerrelaterade DNA-SNV: er, med ett minimum av 200, vilket representerar minst en 30-faldig förbättring jämfört med tidigare hybridiseringsbaserade analyser. Dessutom använde de denna teknologi för att analysera låga VAF-sekvenser från humant genomiskt DNA efter PCR, såväl som direkt på syntetiska RNA-sekvenser.
Utifrån expertisen utvecklade de en ny PCR-metod som heter Blocker Displacement Amplification (BDA). Det är en temperatur-robust PCR som selektivt amplifierar alla sekvensvarianter inom ett ungefär 20 nt-fönster med 1000 gånger över vildtypsekvenser, vilket möjliggör enkel detektion och kvantifiering av hundratals potentialvarianter ursprungligen vid ≤ 0,1 % allelfrekvens. BDA uppnår liknande anrikningsprestanda över glödgningstemperaturer från 56 °C till 64 °C. Denna temperaturstabilitet underlättar multiplexerad anrikning av många olika varianter över genomet och möjliggör dessutom användningen av billiga och bärbara termocykliska instrument för sällsynt DNA-variantdetektering. BDA har validerats även på provtyper inklusive kliniska cellfria DNA-prover som samlats in från blodplasma från lungcancerpatienter.
Ansökningar
- Diagnos av gonokockinfektioner och andra Neisseria-infektioner: Amplifiering av specifika N. gonorrhea-DNA- eller RNA-sekvenser för detektion.
- Diagnos av urogenitala C. trachomatis-infektioner
- Detektion av Mycobacterium tuberculosis
- Detektion av HIV RNA eller DNA
- Detektering av zoonotiska coronavirus
- Diagnostiskt test för SARS-CoV-2
- Detektering av antibiotikaresistenta bakterier efter antibiotikabehandling