Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi

Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi (MMS) är en infraröd spektroskopiteknik som används för att karakterisera den sekundära strukturen hos proteiner . Infraröd (IR) spektroskopi är välkänd för denna applikation. Emellertid har bristen på automatisering, repeterbarhet och dynamiskt detekteringsområde i konventionella plattformar som FTIR varit stora begränsningar som har åtgärdats med utvecklingen av mikrofluidisk moduleringsspektroskopi.

Biofysisk karakterisering analytiska tekniker

Cirkulär dikroismspektroskopi (CD) är en teknik för karakterisering av sekundär struktur. CD är användbart för a-helixproteinanalys på grund av den intensiva signalen som a-helixstrukturer tillhandahåller i CD-regionen. Fourier-transform infraröd spektroskopi (FTIR) sekundär strukturdekonvolution används också för multivariata analystekniker inklusive singularvärdesupplösning, partiella minsta kvadrater, mjuk oberoende modellering av klassanalogi och neurala nätverk.

CD, liksom konventionell FTIR, har också stora nackdelar. Mätning måste utföras vid låga koncentrationer, vanligtvis vid 0,5 mg/ml men ner till så lågt som 0,1 mg/ml, vilket kan undergräva de resulterande data. Närvaron av vissa hjälpämnen i formuleringsbufferten kan också störa mätningarna. CD och konventionell FTIR saknar också känslighet vid karakteriseringen av biofarmaceutiska proteiner såsom immunglobuliner IgG1 och IgG2 . Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi är en automatiserad teknik som övervinner dessa utmaningar med både FTIR och CD för användning i biofarmaceutisk produktkarakterisering.

Ansökningar

Bedömning av högre ordningsstruktur

Karakterisering av proteinstrukturer av högre ordning utförs rutinmässigt under den biologiska produktutvecklingens livscykel. Eftersom biologisk funktion är relaterad till struktur är det viktigt att fastställa att det biologiska är tillverkat med den förväntade strukturen (en monoklonal antikropp skapas med det förväntade β-arket, α-helix, till exempel). Det är också viktigt att visa att strukturen inte påverkas nämnvärt av förändringar i läkemedelssubstans eller läkemedelsprodukttillverkning som uppstår under produktutvecklingen. Mikrofluidisk moduleringsspektroskopins känslighet och noggrannhet detekterar strukturförändringar av högre ordning i formuleringen och vid koncentrationen av intresse, utan behov av utspädning eller deuterering. Tekniken ger information om vilka strukturella motiv i proteinmolekylen som förändras, vilket ger mer vägledning vid utveckling av stabila proteinmolekyler och formuleringar.

Biosimilaritet

Biosimilar läkemedelsutveckling är en viktig applikation för jämförelser av högre ordningsstruktur. I analytiska likhetsstudier jämförs den högre ordningens struktur hos innovatörsprodukten med biosimilaren för att fastställa likheter i strukturerna. Jämförbarhets- och biosimilaritetsstudier använder ofta mikrofluidisk moduleringsspektroskopi för att bedöma produkterna för strukturella skillnader. Tekniken avslöjar mycket små konformationsskillnader mellan olika proteiner och ger information om var dessa skillnader uppstår. Dessa funktioner gör mikrofluidisk moduleringsspektroskopi till ett kraftfullt verktyg för analys och utveckling av biosimilarer .

Aggregation

Proteinaggregation är den process genom vilken proteiner börjar binda samman under olika förhållanden och formuleringar. Om terapeutiska proteiner ska vara säkra och effektiva måste deras felvecknings- och aggregeringsbeteenden förstås väl. Både uppströms och nedströms bearbetning kan orsaka aggregering, en vanlig indikator på proteininstabilitet, vilket kan resultera i att en terapeutisk produkt är olämplig för lansering.

Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi kan mäta tidigare odetekterbara förändringar i proteinstrukturella attribut, förändringar som är avgörande för läkemedels effektivitet och kvalitet. Det är en av de enda teknikerna som direkt kan övervaka bildandet av aggregat på grund av dess förmåga att mäta intermolekylära beta-arkstrukturer.

Formuleringsutveckling

En detaljerad förståelse av mekanismerna för aggregering är avgörande för att kontrollera stabiliteten och säkerställa en säker, effektiv läkemedelsprodukt. En primär motivation i formuleringen är att förstå dessa mekanismer, som drivs av analys med hög genomströmning och intensiv informationsinsamling.

Formuleringsforskare använder en kärnuppsättning analytiska tekniker för att kvantifiera de kolloidala, kemiska och konformationella stabilitetsparametrarna som definierar stabiliteten hos ett bioterapeutiskt medel. Detta är dock en verktygsuppsättning med allmänt erkända luckor, särskilt en oförmåga att mäta konformationsskillnad med hög reproducerbarhet i kliniskt representativa formuleringar. Av skäl som nämnts tidigare tillhandahåller mikrofluidisk moduleringsspektroskopi provkapaciteten genom 96-brunnars plattdrift och tekniska möjligheter för att belysa kolloidal och kemisk stabilitet, som saknas i befintliga tekniker såsom storleksexklusionskromatografi (SEC), masspektrometri och kapillärelektrofores .

Kvalitetssäkring (GMP/CFR-kompatibla laboratorier)

Effektiva kvalitetstester fungerar som en garanti för produktkvalitet, kontrollerar kritiska förändringar i strukturen av läkemedelssubstanser, läkemedelsprodukter, råvaror eller hjälpämnen. Kvalitetssäkring (QA) är ett systematiskt tillvägagångssätt som fastställer en uppsättning riktlinjer för alla aspekter av tillverkningsprocessen som kan påverka produktkvaliteten.

Biologiska läkemedel är komplexa molekyler som uppvisar mikroheterogenitet, mindre kemiska avvikelser som glykanstrukturella skillnader, deamidering , oxidation och glykering . Att kasta ett brett analytiskt nät hjälper till att etablera de robusta struktur-funktionsrelationerna som definierar gränserna för oacceptabla risker. Identifieringen av alla möjliga kritiska kvalitetsattribut (CQA) underbygger effektiv QA. Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi underlättar mätningen av sekundära strukturattribut hos bioläkemedel i alla stadier av tillverkningsprocessen. Detta hjälper till att fastställa kvalitetsparametrar i stadier som inte är möjliga med traditionella tekniker.

Kvantifiering

Proteiners struktur och hur de beter sig i lösning påverkas av koncentrationen. Noggrann koncentrationskvantifiering ger bättre analys och jämförelse av resultat mellan olika proteiner och formuleringar. Det finns inget gemensamt analytiskt tillvägagångssätt för kvantifiering på grund av begränsningarna för traditionella tekniker (t.ex. det begränsade dynamiska omfånget för traditionella spektroskopiska verktyg (till exempel begränsad upplösning och detektorlinjäritet). Eftersom provabsorbansen är inriktad på ett mycket begränsat dynamiskt område, tvingar detta fram forskare att göra extra steg för att justera antingen provkoncentrationen eller cellvägslängden för att uppnå exakt proteinkvantifiering.

Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi ger direkt kvantifiering av etikettfritt protein över ett brett koncentrationsområde och är mer selektiv än traditionell spektroskopiinstrumentering, med mindre känslighet för störningar. Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi ökar känsligheten och minskar avsevärt de fel som är vanliga med konventionell spektroskopi.

Komponenter

Mikrofluidisk moduleringsspektroskopi har en avstämbar mid-infraröd kvantkaskadlaser för att generera en optisk stråle som är 1000 gånger ljusare än de som används i konventionell FTIR . Detta möjliggör mätning av prover som är väsentligt mer koncentrerade än vad som är möjligt med andra tekniker, och användning av enklare detektorer utan krav på kvävekylning. Lasern körs i kontinuerligt vågläge för att generera en mycket hög upplösning (< 0,001 cm-1 linjebredd), lågbrusstråle med minimalt ströljus som fokuseras genom en mikrofluidisk transmissionscell med en kort (25 µm) optisk väglängd på en termoelektriskt kyld kvicksilverkadmiumtellur (MCT) detektor. Denna optiska konfiguration ger hög känslighetsmätning över ett koncentrationsområde på 0,1 – 200 mg/ml för strukturell karakterisering och ner till 0,01 mg/ml för proteinkvantifiering, vilket ger mikrofluidisk moduleringsspektroskopi ett mycket bredare dynamiskt område än alternativa proteinkarakteriseringstekniker.

Vid mikrofluidisk moduleringsspektroskopi införs provlösningen (protein-i-buffert) och en matchande buffertreferensström i transmissionscellen under kontinuerligt flöde och moduleras sedan snabbt (1-10 Hz) över laserstrålens väg för att producera nästan drift- gratis, bakgrundskompenserade, differentiella skanningar av Amide I-bandet. Det kompletta optiska systemet är förseglat och rensat med torr luft för att minimera eventuella störningar från atmosfärisk vattenånga som absorberar över 2000 – 1300 cm-1 vågtalsintervall och kan därför äventyra användningen av IR-spektroskopi för proteinkarakterisering. Avancerad signalbehandlingsteknologi är det tredje nyckelelementet i instrumentet och omvandlar råspektra till fraktionerad bidragsdata för specifika motiv av sekundär struktur, vilket ger ett strukturellt fingeravtryck av proteinet.