Mörk släckare

En mörk quencher (även känd som en mörk sucker ) är ett ämne som absorberar excitationsenergi från en fluorofor och avleder energin som värme ; medan en typisk (fluorescerande) släckare återutsänder mycket av denna energi som ljus . Mörksläckare används inom molekylärbiologin tillsammans med fluoroforer. När de två är nära varandra, till exempel i en molekyl eller ett protein, undertrycks fluoroforens emission. Denna effekt kan användas för att studera molekylär geometri och rörelse.

Ett exempel på dess användning är i TaqMan eller invaderanalys, SNP-genotypningsmetoder . Till exempel används en hårnålsögla med en fluorofor och släckare vid basen av stammen. En omärkt SNP-specifik PCR-primer (en av många) med en specifik 5'-svans binder till sekvensen som ska sonderas, och Taq-polymeraset förlänger sekvensen som kommer att ha en specifik 5'-ände beroende på SNP (okänslig för polymorfismer uppströms om SNP i fråga). I nästa körning förlängs en primer , som kompletterar den svansen, med en hårnålsögla. I nästa körning kommer förlängningen av den komplementära strängen att linjära hårnålen som separerar fluoroforen och quenchern . Ett alternativ till att använda quenchers är att använda FRET där kombinationen av två färgämnen ger en signal.

Funktionssätt

Dark quenchers är färgämnen utan naturlig fluorescens . Fram till de senaste åren har quenchers typiskt varit ett andra fluorescerande färgämne, till exempel fluorescein som reporter och tetrametyl-rhodamin som quencher (FAM/TAM-sonder). Emellertid kan quencher-fluorescens öka bakgrundsbruset på grund av överlappning mellan quencher- och reporterfluorescensspektra. Denna begränsning kräver ofta användningen av komplex dataanalys och optiska filter. Dark quenchers erbjuder en lösning på detta problem eftersom de inte upptar en emissionsbandbredd. Dessutom möjliggör mörksläckare multiplexering (när två eller flera reporter-quencher-sonder används tillsammans).

Fluorescerande färgämnen absorberar ljus, vilket placerar färgämnet i ett exciterat tillstånd; färgen återgår till grundtillståndet från det exciterade tillståndet genom att emittera ljus (fluorescens). I ett reporter-quencher-system överför färgämnet icke-strålande (utan ljus) energi till quenchern. Detta återför färgämnet till grundtillståndet och genererar det exciterade quencher-tillståndet. Släckaren återgår sedan till grundtillståndet genom emissiv sönderfall ( fluorescens ) eller icke-strålning (mörk släckning). Vid icke-strålande eller mörkt sönderfall avges energi via molekylära vibrationer (värme). Med den typiska μM eller lägre koncentrationen av provet är värmen från strålningsfritt sönderfall för liten för att påverka temperaturen på lösningen.

Exempel på mörksläckare

Dabsyl (dimetylaminoazobensensulfonsyra) absorberas i det gröna spektrumet och används ofta med fluorescein. (Dabsyl har en nästan identisk absorption, men har en sulfonylklorid för att bilda mer stabila konjugat, istället för en succinimidylester).
Black Hole Quenchers kan släcka över hela det synliga spektrumet.
Qxl-dämpare spänner över hela det synliga spektrumet.
Iowa Black FQ absorberar i den gröngula delen av spektrumet.
Iowa Black RQ block i den orangeröda delen av spektrumet.
IRDye QC-1 släcker färgämnen från det synliga till det nära-infraröda området (500-900 nm).

Vidare läsning

J. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy , 2:a upplagan, Plenum, New York, 1999 .
Johansson, MK; Cook, RM (2003). "Intramolekylära dimerer: en ny designstrategi för fluorescenssläckta sonder". Chem. Eur. J . 9 (15): 3466–3471. doi : 10.1002/chem.200304941 . PMID 12898673 .

externa länkar

Invitrogen Handbook: QSY färgämnen.
IRDye QC-1 Universal Quencher (500-900 nm)