Kinetisk uteslutningsanalys
En kinetisk uteslutningsanalys ( KinExA ) är en typ av bioanalys där en lösning som innehåller receptor , ligand och receptor-ligandkomplex kortvarigt exponeras för ytterligare ligand immobiliserad på en fast fas.
Beskrivning
Under analysen fångas en del av den fria receptorn av fastfasliganden och märks därefter med en fluorescerande sekundär molekyl (Figur 1). Den korta kontakttiden med den fasta fasen tillåter inte signifikant dissociation av de förbildade komplexen i lösningen. Lösningsdissociation är alltså "kinetiskt utesluten" från att bidra till den fångade receptorn och den resulterande signalen ger ett mått på den fria receptorn i lösningen.
Mätning av den fria receptorn som en funktion av total ligand i en serie av ekvilibrerade lösningar möjliggör beräkning av jämviktsdissociationskonstanten (Kd ) . Att mäta den fria receptorn med flera punkter före jämvikt möjliggör mätning av associationshastighetskonstanten (k on ). Off-hastigheten (k off ) kan också mätas direkt, men den beräknas vanligtvis från den uppmätta K d och uppmätta k on , (k off = K d * k on ).
Kinetiska uteslutningsanalyser har använts för att mäta Kd i det nanomolära till femtomolära området.
Ansökningar
Eftersom den fluorescerande sekundära molekylen appliceras efter infångning av den fria receptorn från lösningen (Figur 2) är bindningskonstanterna som mäts med hjälp av en kinetisk uteslutningsanalys för omodifierade molekyler i lösning och återspeglar således mer exakt endogena bindningsinteraktioner än metoder som kräver modifiering (vanligtvis märkning eller immobilisering) före mätning. Kinetiska uteslutningsanalyser har utförts med användning av orenade molekyler, i serum, och har mätt bindning till cellmembranproteiner på intakta helceller, vilket för de uppmätta bindningsinteraktionerna närmare deras endogena tillstånd.
Molekyler lämpade för mätning med KinExA är antikroppar , rekombinanta proteiner , små molekyler, aptamerer , lipider, nanokroppar och toxiner.
Kinetisk uteslutningsanalys har också använts för koncentrationsimmunanalys, där den har visat sig kunna ge den maximala teoretiska, Kd- begränsade , känsligheten. Ett exempel på denna teknik har använts för känslig detektering av miljöföroreningar i nästan realtid.
Standardjämviktsaffinitetsanalys
En serie prover bereds med alla samma receptor (R) koncentration men där ligand (L) koncentrationen titreras . Efter att jämvikt har uppnåtts mäts varje prov genom att det flödar genom kolonnen (Figur 2).
För 1:1 reversibel bindning definieras Jämvikt Kd som
(1) Kd ≡k av /k på =R*L / RL
bindningen är reversibel så konservering av massa kan skrivas som
(2) RT = R+RL
(3) L T = L + RL
Var:
Kd = jämviktsdissociationskonstant
k on = forward rate konstant
k off = omvänd hastighetskonstant
R = koncentration av fritt receptorställe vid jämvikt
L = koncentration av fritt ligandställe vid jämvikt
RL = koncentration av komplex vid jämvikt
R T = total koncentration av receptorer
L T = total koncentration av ligand
En enkel ekvation som relaterar den fria fraktionen av R (=R/R T ) till Kd och L T anpassas sedan till de uppmätta data för att hitta Kd för interaktionen.
Analys av hastighetskonstant
För att mäta hastighetskonstanterna blandas kända koncentrationer av receptor och ligand i lösning och mängden fri receptor mäts upprepade gånger över tiden när lösningsfasreaktionen inträffar. Tidsförloppet för den fria receptorutarmningen anpassas sedan med en standardekvation för bimolekylär hastighet.
(4) d LR /d t = k på ∙R∙L - K d ∙k på ∙RL
där K d *k on har ersatts med k off .