Imaging partikelanalys
Imaging partikelanalys är en teknik för att göra partikelmätningar med digital avbildning , en av de tekniker som definieras av det bredare begreppet partikelstorleksanalys . De mätningar som kan göras inkluderar partikelstorlek , partikelform (morfologi eller formanalys och gråskala eller färg , såväl som fördelningar (grafer) av statistiska populationsmätningar .
Beskrivning och historia
Avbildningspartikelanalys använder de tekniker som är vanliga för bildanalys eller bildbehandling för analys av partiklar. Partiklar definieras här per partikelstorleksanalys som partikelformiga fasta ämnen, och inkluderar därmed inte atomära eller subatomära partiklar. Dessutom är den här artikeln begränsad till verkliga bilder (optiskt formade), till skillnad från "syntetiska" (datoriska) bilder ( datortomografi , konfokalmikroskopi , SIM och andra superupplösningsmikroskopitekniker , etc.).
Med tanke på ovanstående är den primära metoden för avbildning av partikelanalys att använda optisk mikroskopi. Medan optiska mikroskop har funnits och använts för partikelanalys sedan 1600-talet, har "analysen" i det förflutna utförts av människor som använder det mänskliga visuella systemet . Som sådan är mycket av denna analys subjektiv eller kvalitativ till sin natur. Även när någon form av kvalitativa verktyg är tillgängliga, såsom ett mätkors i mikroskopet, har det fortfarande krävt en människa att bestämma och registrera dessa mätningar.
Från och med slutet av 1800-talet med tillgängligheten av fotografiska plattor , blev det möjligt att fånga mikroskopbilder permanent på film eller papper, vilket gör mätningar lättare att förvärva genom att helt enkelt använda en skalad linjal på papperskopia-bilden. Även om detta avsevärt påskyndade förvärvet av partikelmätningar, var det fortfarande en tråkig, arbetskrävande process, som inte bara gjorde det svårt att mäta statistiskt signifikanta partikelpopulationer, utan också introducerade en viss grad av mänskliga fel i processen.
Slutligen, med början ungefär i slutet av 1970-talet, började CCD digitala sensorer för att fånga bilder och datorer som kunde bearbeta dessa bilder revolutionera processen genom att använda digital bildbehandling . Även om de faktiska algoritmerna för att utföra digital bildbehandling hade funnits ett tag, var det inte förrän den betydande beräkningskraft som krävs för att utföra dessa analyser blev tillgänglig till rimliga priser som digitala bildbehandlingstekniker kunde användas i mainstream. Det första systemet för dynamisk avbildning av partikelanalys patenterades 1982. När snabbare datorresurser blev tillgängliga till lägre kostnader kunde uppgiften att göra mätningar från mikroskopbilder av partiklar nu utföras automatiskt med maskin utan mänsklig inblandning, vilket gjorde det möjligt att mäta betydligt större antal partiklar på mycket kortare tid.
Metoder för bildinsamling
Den grundläggande processen genom vilken avbildningspartikelanalys utförs är följande:
- En digitalkamera fångar en bild av synfältet i det optiska systemet.
- En gråskaletröskelprocess används för att utföra bildsegmentering , separera ut partiklarna från bakgrunden, skapa en binär bild av varje partikel.
- Digital bildbehandlingsteknik används för att utföra bildanalysoperationer , vilket resulterar i morfologiska och gråskalemätningar som ska lagras för varje partikel.
- Mätningarna som sparas för varje partikel används sedan för att generera bildpopulationsstatistik, eller som indata till algoritmer för att filtrera och sortera partiklarna i grupper av liknande typer. I vissa system kan sofistikerade mönsterigenkänningstekniker också användas för att separera olika partikeltyper som finns i ett heterogent prov.
Avbildningspartikelanalysatorer kan delas in i två olika typer, statiska och dynamiska, baserat på bildinsamlingsmetoderna. Medan de grundläggande principerna är desamma, är metoderna för bildinsamling olika till sin natur, och alla har fördelar och nackdelar.
Statisk avbildning partikelanalys
Statisk bildinsamling är den vanligaste formen. Nästan alla mikroskop kan enkelt anpassas för att acceptera en digitalkamera via en C-monteringsadapter . Denna typ av uppställning kallas ofta för ett digitalt mikroskop , även om många system som använder det namnet endast används för att visa en bild på en bildskärm .
Provet prepareras på ett objektglas som placeras på mikroskopbordet . När provet har fokuserats kan en bild hämtas och visas på monitorn. Om det är en digitalkamera eller en framegrabber finns kan bilden nu sparas i digitalt format, och bildbehandlingsalgoritmer kan användas för att isolera partiklar i synfältet och mäta dem.
Vid statisk bildinhämtning tas endast ett synfältsbild åt gången. Om användaren vill avbilda andra delar av samma prov på objektglaset kan de använda XY-positioneringshårdvaran (vanligtvis sammansatt av två linjära steg på mikroskopet för att flytta till ett annat område av objektglaset. Försiktighet måste iakttas för att säkerställa att två bilder överlappar inte varandra för att inte räkna och mäta samma partiklar mer än en gång.
Den stora nackdelen med statisk bildinsamling är att det är tidskrävande, både vid provberedning (att få provet på objektglaset med lämplig utspädning vid behov), och vid flera rörelser av scenen för att kunna få ett statistiskt signifikant antal av partiklar att räkna/mäta. Datorstyrda XY-positioneringssteg används ibland i dessa system för att påskynda processen och minska mängden operatörsingripanden, men det är fortfarande en tidskrävande process, och de motoriserade stegen kan vara dyra på grund av den precisionsnivå som krävs när arbetar med hög förstoring.
De stora fördelarna med statiska partikelavbildningssystem är användningen av standardmikroskopsystem och enkelhet i skärpedjupsöverväganden . Eftersom dessa system kan göras från vilket standard optiskt mikroskop som helst, kan de vara en billigare metod för människor som redan har mikroskop. Viktigare är dock att mikroskopbaserade system har mindre skärpedjupsproblem i allmänhet jämfört med dynamiska bildsystem. Detta beror på att provet placeras på ett objektglas och sedan vanligtvis täcks med ett täckglas , vilket begränsar planet som innehåller partiklarna i förhållande till den optiska axeln . Detta innebär att fler partiklar kommer att vara i acceptabelt fokus vid höga förstoringar.
Dynamisk avbildning partikelanalys
Vid dynamisk bildinsamling avbildas stora mängder prov genom att flytta provet förbi mikroskopoptiken och använda höghastighetsblixtbelysning för att effektivt "frysa" provets rörelse. Blixten är synkroniserad med en hög slutartid i kameran för att ytterligare förhindra rörelseoskärpa. I ett torrt partikelsystem dispenseras partiklarna från ett skakbord och faller genom gravitationen förbi det optiska systemet. I system för analys av partiklar för vätskeavbildning förs vätskan över den optiska axeln med hjälp av en smal flödescell som visas till höger.
Flödescellen kännetecknas av sitt djup vinkelrätt mot den optiska axeln, som visas i det andra diagrammet till höger. För att hålla partiklarna i fokus begränsas flödesdjupet så att partiklarna förblir i ett plan med bästa fokus vinkelrätt mot den optiska axeln. Detta liknar i konceptet effekten av mikroskopglaset plus täckglas i ett statiskt bildsystem. Eftersom skärpedjupet minskar exponentiellt med ökande förstoring måste flödescellens djup minskas avsevärt med högre förstoringar.
Den stora nackdelen med dynamisk bildinsamling är att flödescelldjupet måste begränsas såsom beskrivits ovan. Detta innebär att partiklar som är större än flödescelldjupet i allmänhet inte kan tillåtas i provet som bearbetas, eftersom de troligen kommer att täppa igen systemet. Så provet kommer vanligtvis att behöva filtreras för att avlägsna partiklar som är större än flödescellens djup innan det utvärderas. Om det är önskvärt att titta på ett mycket brett område av partikelstorlekar, kan detta innebära att provet måste fraktioneras till komponenter med mindre storleksintervall och köras med olika kombinationer av förstoring/flödescell.
Den stora fördelen med dynamisk bildinsamling är att den möjliggör insamling och mätning av partiklar med betydligt högre hastighet, vanligtvis i storleksordningen 10 000 partiklar/minut eller mer. Detta innebär att statistiskt signifikanta populationer kan analyseras under mycket kortare tidsperioder än vad som tidigare varit möjligt med manuell mikroskopi eller till och med statisk avbildningspartikelanalys. I denna mening kombinerar dynamiska avbildningspartikelanalyssystem den hastighet som är typisk för partikelräknare med mikroskopins diskriminerande förmåga.
Dynamisk avbildningspartikelanalys används i akvatisk mikroorganismforskning för att analysera växtplankton, djurplankton och andra akvatiska mikroorganismer som sträcker sig från 2 um till 5 mm i storlek. Dynamisk avbildningspartikelanalys är också biofarmaceutisk forskning för att karakterisera och analysera partiklar som sträcker sig från 300 nm till 5 mm i storlek.
Mikroflödesavbildning
Micro-flow imaging (MFI) är en partikelanalysteknik som använder flödesmikroskopi för att kvantifiera partiklar som finns i en lösning baserat på storlek. Denna teknik används inom den biofarmaceutiska industrin för att karakterisera undersynliga partiklar från cirka 1 μm till >50 μm.