Genotypning genom sekvensering
Inom området genetisk sekvensering är genotypning genom sekvensering , även kallat GBS , en metod för att upptäcka singelnukleotidpolymorfismer (SNP) för att utföra genotypningsstudier , såsom genomomfattande associationsstudier ( GWAS ). GBS använder restriktionsenzymer för att minska genomets komplexitet och genotypa flera DNA-prover. Efter digestion PCR för att öka fragmentpoolen och sedan sekvenseras GBS-bibliotek med hjälp av nästa generations sekvenseringsteknologier, vilket vanligtvis resulterar i cirka 100 bp enkeländsläsningar. Det är relativt billigt och har använts i växtförädling . Även om GBS presenterar ett tillvägagångssätt som liknar restriktionsställe-associerad DNA-sekvenseringsmetod (RAD-seq), skiljer de sig åt på några väsentliga sätt.
Metoder
GBS är en robust, enkel och prisvärd procedur för SNP-upptäckt och kartläggning. Sammantaget minskar detta tillvägagångssätt genomets komplexitet med restriktionsenzymer (RE) i arter med hög mångfald, stora genom för effektiv hög genomströmning, mycket multiplexerad sekvensering. Genom att använda lämpliga RE:er kan repetitiva regioner av genom undvikas och lägre kopiaregioner kan riktas mot, vilket minskar anpassningsproblem i genetiskt mycket olika arter. Metoden beskrevs först av Elshire et al. (2011). Sammanfattningsvis extraheras och spjälkas DNA med hög molekylvikt med användning av en specifik RE som tidigare definierats genom att ofta skära i den större repetitiva fraktionen av genomet. ApeKI är den mest använda RE. Streckkodsadaptrar ligeras sedan till klibbiga ändar och PCR-amplifiering utförs. Nästa generations sekvenseringsteknik utförs vilket resulterar i cirka 100 bp single-end-läsningar. Rå sekvensdata filtreras och anpassas till ett referensgenom med vanligtvis Burrows–Wheeler alignment tool (BWA) eller Bowtie 2 . Nästa steg är att identifiera SNP från justerade taggar och poängsätta alla upptäckta SNPs för olika täckning, djup och genotypisk statistik. När en storskalig, artövergripande SNP-produktion har körts, är det möjligt att snabbt anropa kända SNP i nysekvenserade prover.
När den ursprungligen utvecklades testades och validerades GBS-metoden i rekombinanta inavlade linjer (RIL) från en högupplöst majskarteringspopulation (IBM) och dubbla haploida (DH) kornlinjer från kartläggningspopulationen Oregon Wolfe Barley (OWB). Upp till 96 RE (ApeKI)-digererade DNA-prover poolades och bearbetades samtidigt under GBS-bibliotekskonstruktionen, som kontrollerades på en Genome Analyzer II (Illumina, Inc.). Totalt kartlades 25 185 bialleliska taggar i majs, medan 24 186 sekvenstaggar kartlades i korn. Korn GBS-markörvalidering med en enda DH-linje (OWB003) visade 99 % överensstämmelse mellan referensmarkörerna och de kartlade GBS-avläsningarna. Även om korn saknar en fullständig genomsekvens, kräver GBS inget referensgenom för sekvenstaggkartläggning, referensen utvecklas under processen för provtagning av genotypning. Taggar kan också behandlas som dominerande markörer för alternativ genetisk analys i frånvaro av ett referensgenom. Förutom multiplex GBS-skimming, har imputering av saknade SNP:er potential att ytterligare minska GBS-kostnaderna. GBS är en mångsidig och kostnadseffektiv procedur som gör det möjligt att bryta genom av vilken art som helst utan förkunskap om dess genomstruktur.