Fluorescensförlust vid fotoblekning
Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP) är en fluorescensmikroskopiteknik som används för att undersöka rörelser av molekyler inuti celler och membran. Ett cellmembran är vanligtvis märkt med ett fluorescerande färgämne för att möjliggöra observation. Ett specifikt område av denna märkta sektion blekas sedan flera gånger med hjälp av strålen från ett konfokalt laserskanningsmikroskop . Efter varje bildgenomsökning sker blekning igen. Detta sker flera gånger för att säkerställa att alla tillgängliga fluoroforer blekas eftersom oblekta fluoroforer byts ut mot blekta fluoroforer, vilket orsakar rörelse genom cellmembranet. Mängden fluorescens från den regionen mäts sedan över en tidsperiod för att bestämma resultaten av fotoblekningen på cellen som helhet.
Experimentuppställning
Innan fotoblekning kan ske måste cellerna injiceras med ett fluorescerande protein, ofta ett grönt fluorescerande protein (GFP), vilket gör att målproteinerna kan fluorescera och därför följas under hela processen. Sedan måste en region av intresse definieras. Denna initiala region av intresse innehåller vanligtvis hela cellen eller flera celler. I FLIP sker fotoblekning strax utanför området av intresse; därför måste ett område för fotoblekning också definieras. En tredje region, den region där mätningen kommer att ske, måste också fastställas. Ett antal inledande skanningar måste göras för att bestämma fluorescens innan fotoblekning. Dessa skanningar kommer att fungera som kontrollskanningar, som de fotoblekta skanningarna kommer att jämföras med senare. Fotoblekning kan då inträffa. Mellan varje blekningspuls är det nödvändigt att ge tid för återhämtning av fluorescerande material. Det är också viktigt att ta flera skanningar av området av intresse omedelbart efter varje blekmedelspuls för vidare studier. Förändringen i fluorescens i området av intresse kan sedan kvantifieras på ett av tre sätt. Det vanligaste är att välja plats, storlek och antal för regionerna av intresse baserat på visuell inspektion av bilduppsättningarna. De två andra, ganska nya men mer tillförlitliga metoderna är antingen genom att detektera områden med olika sondrörlighet på individuell bildbasis eller genom fysisk modellering av fluorescensförlust från rörliga kroppar.
Förlust av fluorescens definieras av den mobila fraktionen, eller fraktionen av fluoroforer som kan återhämta sig till ett fotoblekt område, av det fluorescensmärkta proteinet. Ofullständig förlust av fluorescens indikerar att det finns fluoroforer som inte rör sig eller reser till det blekta området. Detta möjliggör definition av den orörliga fraktionen, eller fraktionen av fluoroforer som inte kan återhämta sig till ett fotoblekt område, av fluorescensmärkta proteiner. Orörlighet indikerar att det finns proteiner som kan finnas i fack som är avstängda från resten av cellen, vilket hindrar dem från att påverkas av den upprepade fotoblekningen.
Ansökningar
Verifiering av kontinuitet hos membranorganeller
Den primära användningen av FLIP är att bestämma kontinuiteten hos membranösa organeller. Denna kontinuitet eller avsaknad därav bestäms genom att observera mängden fluorescens i området av intresse. Om det finns en fullständig förlust av fluorescens, indikerar detta att organellerna är kontinuerliga. Men om det finns ofullständig förlust av fluorescens, så finns det ingen kontinuitet mellan organellerna. Istället är dessa organeller uppdelade i fack och därför stängda för överföring av eventuella fotoblekta fluoroforer. Kontinuiteten för Golgi-apparaten, endoplasmatiskt retikulum och kärna har verifierats med FLIP.
Växelkurs mellan kärnan och cytoplasman
Två av de andra, mer sällan använda användningarna av FLIP är att bestämma hur proteiner skjuts från cytoplasman till kärnan och sedan bestämma hastigheten med vilken denna överföring sker. För att avgöra vilka delar som är inblandade och när i skyttelprocessen de är involverade, observeras kontinuerliga skanningar. Ju snabbare en del av cytoplasman används i skyttelprocessen, desto snabbare upplever den fullständig förlust av fluorescens. Den resulterande bilden av denna process bör vara en helt fotoblekt cytoplasma. Om cellen även deltar i kärnexport från kärnan till cytoplasman kommer fotoblekning även att ske i kärnan.
Växelkursen mellan kärnan och cytoplasman kan också bestämmas utifrån denna typ av data. I dessa fall är området för fotoblekning inom kärnan. Om skytteln sker i snabb takt kommer fluorescensnivåerna inom kärnkraftsavdelningarna att minska snabbt genom de tagna bilderna. Men om skytteln sker långsamt kommer fluorescensnivåerna att förbli opåverkade eller endast minska något.
FLIP vs. FRAP
FLIP används ofta och är nära förknippat med fluorescensåtervinning efter fotoblekning ( FRAP). Den största skillnaden mellan dessa två mikroskopitekniker är att FRAP involverar studiet av en cells förmåga att återhämta sig efter en enda fotoblekningshändelse medan FLIP involverar studiet av hur förlusten av fluorescens sprider sig i hela cellen efter flera fotoblekningshändelser. Denna skillnad i syfte leder också till en skillnad i vilka delar av cellen som observeras. I FRAP är det område som faktiskt är fotoblekt området av intresse. Omvänt, i FLIP, är regionen av intresse strax utanför regionen som fotoblekas. En annan viktig skillnad är att i FRAP finns det en enda fotoblekningshändelse och en återhämtningsperiod för att observera hur väl fluoroforer rör sig tillbaka till den blekta platsen. I FLIP inträffar dock flera fotoblekningshändelser för att förhindra återkomsten av oblekta fluoroforer till blekningsområdet. Liksom FLIP används FRAP i studiet av kontinuitet hos membranösa organeller. FLIP och FRAP används ofta tillsammans för att bestämma rörligheten hos GFP-märkta proteiner. FLIP kan också användas för att mäta molekylär överföring mellan regioner i en cell oavsett rörelsehastigheten. Detta möjliggör en mer omfattande analys av proteinhandel inom en cell. Detta skiljer sig från FRAP som i första hand är användbart för att bestämma rörligheten för proteiner i regioner som är lokala för fotoblekning.
Potentiella komplikationer
Det finns flera komplikationer som är involverade med både FLIP och FRAP. Eftersom båda formerna av mikroskopi undersöker levande celler, finns det alltid en möjlighet att cellerna kommer att röra sig, vilket orsakar falska resultat. Det bästa sättet att undvika detta är att använda en inriktningsalgoritm, som kommer att kompensera för alla rörelser och eliminera en stor del av felet på grund av rörelse. I dessa experiment är det också viktigt att ha en kontrollgrupp för att justera resultaten och korrigera återhämtningskurvan för den totala förlusten av fluorescens. Ett annat sätt att minimera fel är att hålla fotoblekning i en enda region eller område. Denna begränsning kommer att fungera som en kontroll och begränsa fluorescensförlust på grund av fotoskada jämfört med fluorescensförlust på grund av fotoblekning.