Extracellulärt RNA

Extracellulärt RNA ( exRNA ) beskriver RNA- arter som finns utanför cellerna där de transkriberades. Bärna i extracellulära vesiklar , lipoproteiner och proteinkomplex , är exRNA skyddade från allestädes närvarande RNA-nedbrytande enzymer . exRNA kan hittas i miljön eller, i flercelliga organismer, i vävnaderna eller biologiska vätskor såsom venöst blod, saliv, bröstmjölk, urin, sperma, menstruationsblod och vaginalvätska. Även om deras biologiska funktion inte är helt klarlagd, har exRNA föreslagits spela en roll i en mängd olika biologiska processer inklusive syntrofi , intercellulär kommunikation och cellreglering. United States National Institute of Health (NIH) publicerade 2012 en uppsättning begäranden om ansökningar (RFA) för att undersöka extracellulär RNA-biologi. Det resulterande programmet finansierades av NIH Common Fund och var gemensamt känt som Extracellular RNA Communication Consortium (ERCC). ERCC förnyades för en andra fas 2019.

Bakgrund

En tecknad representation av de miljöer där extracellulära RNA har upptäckts.

Både prokaryota och eukaryota celler är kända för att frisätta RNA, och denna frisättning kan vara passiv eller aktiv. Maskineriet för endosomalt sorteringskomplex som krävs för transport (ESCRT) ansågs tidigare som en möjlig mekanism för RNA-utsöndring från cellen, men på senare tid har forskning som studerat mikroRNA-utsöndring i mänskliga embryonala njurceller och Cercopithecus aethiops njurceller identifierat neutral sfingomyelinas 2 (nSMase2), ett enzym involverat i ceramidbiosyntes, som en regulator av mikroRNA-utsöndringsnivåer. ExRNAs finns ofta förpackade i vesiklar såsom exosomer , ektosomer, prostasomer , mikrovesiklar och apoptotiska kroppar. Även om RNA kan utsöndras från cellen utan en omslutande behållare, ribonukleaser som finns i extracellulära miljöer så småningom bryta ner molekylen.

Typer

Extracellulärt RNA ska inte ses som en kategori som beskriver en uppsättning RNA med en specifik biologisk funktion eller som tillhör en viss RNA-familj. I likhet med termen " icke-kodande RNA " definierar "extracellulärt RNA" en grupp av flera typer av RNA vars funktioner är olika, men de delar ett gemensamt attribut som, i fallet med exRNA, är existens i en extracellulär miljö. Följande typer av RNA har hittats utanför cellen:

Messenger RNA ( mRNA )
Överför RNA ( tRNA )
MicroRNA ( miRNA )
Litet störande RNA ( siRNA )
Långt icke-kodande RNA ( lncRNA )

rRNA ) är vanligt inne i cellen, verkar det inte vara ett vanligt exRNA. Ansträngningar av Valadi et al. för att karakterisera exosomalt RNA med hjälp av Agilent Bioanalyzer-teknologin visade få eller inga spår av 18S och 28S rRNA i exosomer som utsöndras av MC/9 murina mastceller, och liknande slutsatser gjordes av Skog et al . för rRNA i gliobastoma mikrovesiklar.

Fungera

För att fungera eller till och med överleva som fullängds-RNA i extracellulära miljöer måste exRNA skyddas från matsmältning av RNaser. Detta krav gäller inte prokaryotisk syntrofi, där smälta nukleotider återvinns. exRNA kan skyddas från RNaser av RNA-bindande proteiner (RBP), på egen hand eller inom/associerat med lipoproteinpartiklar och extracellulära vesiklar . Speciellt extracellulära vesiklar tros vara ett sätt att transportera RNA mellan celler, i en process som kan vara generell eller mycket specifik, till exempel på grund av inkorporering av markörer för modercellen som kan kännas igen av receptorer på mottagarcellen. Biokemiska bevis stöder tanken att exRNA-upptag är en vanlig process, vilket tyder på nya vägar för intercellulär kommunikation. Som ett resultat kan närvaro, frånvaro och relativ överflöd av vissa exRNA korreleras med förändringar i cellulär signalering och kan indikera specifika sjukdomstillstånd.

Trots en begränsad förståelse för exRNA-biologi har aktuell forskning visat att exRNA:s roll är mångfacetterad. Extracellulära miRNA kan rikta in sig på mRNA i mottagarcellen genom RNA-interferensvägar . In vitro -experiment har visat överföring av specifika exRNA till mottagarceller som hämmar proteinuttryck och förhindrar cancercelltillväxt. Förutom att mRNA regleras av exRNA kan mRNA fungera som exRNA för att bära genetisk information mellan celler. Budbärar-RNA som finns i mikrovesiklar utsöndrade från glioblastomala celler visades generera ett funktionellt protein i mottagarceller (human hjärna mikrovaskulära endotelceller) in vitro . I en annan studie av extracellulära mRNA, utlöste mRNA som transporterades av mikrovesiklar från endotelceller (EPC) till humana mikrovaskulära och makrovaskulära endotelceller angiogenes i både in vitro och in vivo- miljö. Verk av Hunter et al. använde mjukvaran Ingenuity Pathway Analysis (IPA) som förknippade exRNA som finns i mikrovesiklar i mänskligt blod med vägar involverade i blodcellsdifferentiering, metabolism och immunfunktion. Dessa experimentella och bioinformatiska analyser gynnar hypotesen att exRNA spelar en roll i många biologiska processer.

Upptäckt

Flera metoder har utvecklats eller anpassats för att detektera, karakterisera och kvantifiera exRNA från biologiska prover. RT-PCR , cDNA-mikroarrayer och RNA-sekvensering är vanliga tekniker för RNA-analys. Att tillämpa dessa metoder för att studera exRNA skiljer sig huvudsakligen från cellulära RNA-experiment i RNA-isolerings- och/eller extraktionsstegen.

RT-PCR

För kända exRNA-nukleotidsekvenser kan RT-PCR användas för att detektera deras närvaro i ett prov samt kvantifiera deras överflöd. Detta görs genom att först omvänd transkribera RNA-sekvensen till cDNA. cDNA:t fungerar sedan som en mall för PCR-amplifiering. De största fördelarna med att använda RT-PCR är dess kvantitativa noggrannhet i ett dynamiskt område och ökad känslighet jämfört med metoder som RNase-skyddsanalyser och dot blot-hybridisering. Nackdelen med RT-PCR är kravet på kostsamma leveranser och nödvändigheten av en sund experimentell design och en djupgående förståelse av normaliseringstekniker för att få korrekta resultat och slutsatser.

Mikrofluidik

Mikrofluidiska plattformar som Agilent Bioanalyzer är användbara för att bedöma kvaliteten på exRNA-prover. Med Agilent Bioanalyzer mäter en lab-on-chip- teknik som använder ett prov av isolerat RNA längden och mängden RNA i provet, och resultaten av experimentet kan representeras som en digital elektroforesgelbild eller ett elektroferogram . Eftersom ett brett spektrum av RNA kan detekteras med denna teknik, är det en effektiv metod för att mer allmänt bestämma vilka typer av RNA som finns i exRNA-prover genom att använda storlekskarakterisering. ^{[ citat behövs ]}

cDNA-mikroarrayer

Mikroarrayer möjliggör större exRNA-karakterisering och kvantifiering. Mikroarrayer som används för RNA-studier genererar först olika cDNA-oligonukleotider (sonder) som är fästa på mikroarraychippet. Ett RNA-prov kan sedan läggas till chippet, och RNA med sekvenskomplementaritet till cDNA-proben kommer att binda och generera en fluorescerande signal som kan kvantifieras. Mikro-RNA-matriser har använts i exRNA-studier för att generera miRNA-profiler av kroppsvätskor.

RNA-sekvensering

Tillkomsten av massivt parallell sekvensering (nästa generations sekvensering) leder till variationer i DNA-sekvensering som möjliggjorde analyser med hög genomströmning av många genomiska egenskaper. Bland dessa DNA-sekvenseringshärledda metoder är RNA-sekvensering. Den största fördelen med RNA-sekvensering jämfört med andra metoder för exRNA-detektion och kvantifiering är dess högkapacitetskapacitet. Till skillnad från mikroarrayer är RNA-sekvensering inte begränsad av faktorer som oligonukleotidgenerering och antalet prober som kan läggas till ett chip. Indirekt RNA-sekvensering av exRNA-prover involverar generering av ett cDNA-bibliotek från exRNA följt av PCR-amplifiering och sekvensering. 2009 publicerade Helicos Biosciences en metod för direkt sekvensering av RNA-molekyler som kallas Direct RNA Sequencing (DRS™). Oavsett RNA-sekvenseringsplattformen existerar inneboende fördomar i olika steg i experimentet, men metoder har föreslagits för att korrigera för dessa fördomar med lovande resultat.

Klinisk signifikans

Eftersom växande bevis stöder funktionen av exRNA som intercellulära kommunikatörer undersöker forskningsinsatser möjligheten att använda exRNA i sjukdomsdiagnostik, prognos och terapi.

Biomarkörer

Potentialen hos extracellulära RNA att fungera som biomarkörer är betydande inte bara på grund av deras roll i intercellulär signalering utan också på grund av utvecklingen inom nästa generations sekvensering som möjliggör profilering med hög genomströmning. Den enklaste formen av en exRNA-biomarkör är närvaron (eller frånvaron) av ett specifikt extracellulärt RNA. Dessa biologiska signaturer har upptäckts i exRNA-studier av cancer, diabetes, artrit och prionrelaterade sjukdomar. Nyligen antydde en bioinformatisk analys av extracellulära vesiklar extraherade från Trypanosoma cruzi , där SNP:er bröts från transkriptomiska data, att exRNA kan vara biomarkörer för försummade sjukdomar som Chagas sjukdom .

Cancer

Ett stort forskningsområde av intresse för exRNA har varit dess roll i cancer. Tabellen nedan (anpassad från Kosaka et al. ) listar flera typer av cancer där exRNA har visats vara associerade:

Typ	ExRNA Biomarker Candidate
Diffust stort B-cellslymfom (DLBCL)	Uttrycksnivåer av miR-155, miR-210 och miR-21 var högre i DLBCL-patientserum jämfört med kontrollsera; Högt miR-21-uttryck var associerat med återfallsfri överlevnad
Prostatacancer	Serumnivåer av miR-141 kan skilja patienter med prostatacancer från friska kontroller
Äggstockscancer	Nivåerna av de 8 specifika miRNA:n var likartade mellan cellulära och exosomala miRNA. Exosomal miRNA från äggstockscancerpatienter uppvisade liknande profiler, som var signifikant skilda från profiler som observerats vid benign sjukdom; miR-21, miR-92, miR-93, miR-126 och miR-29a var signifikant överuttryckta i serum från cancerpatienter jämfört med kontroller
Icke småcellig lungcancer	Elva serum miRNA visade sig förändras mer än 5 gånger mellan grupper med längre överlevnad och kortare överlevnadsgrupper, och nivåer av fyra miRNA var signifikant associerade med total överlevnad
Akut myeloid leukemi och akut lymfatisk leukemi	miR-92a minskade i plasman hos patienter med akut leukemi
Bröstcancer	Ökade miR-195-nivåer hos patienter återspeglades i tumörer, och cirkulerande nivåer av miR-195 och let-7a minskade hos cancerpatienter postoperativt, till nivåer jämförbara med kontrollpersoner; miR-155 uttrycktes differentiellt i serum från kvinnor med hormonkänsliga jämfört med kvinnor med hormonokänsliga bröstcancer
Magcancer	Plasmakoncentrationerna av miR-17-5p, miR-21, miR-106a och miR-106b var signifikant högre hos patienter än kontroller, medan let-7a var lägre hos patienter
Bukspottskörtelcancer	Cirkulerande miR-210-nivåer är förhöjda hos patienter med pankreascancer
Pankreatisk duktal adenokarcinom	De kombinerade analyserna av fyra miRNA (miR-21, miR-210, miR-155 och miR-196a) i plasma kan skilja patienter från normala friska individer
Skivepitelcancer (SCC) i tungan	Plasma miR-184-nivåer var signifikant högre hos tunga SCC-patienter i jämförelse med normala individer, och nivåerna reducerades signifikant efter kirurgiskt avlägsnande av de primära tumörerna
Kolorektal cancer	Både miR-17-3p och miR-92 var signifikant förhöjda hos patienterna, och plasmanivåerna av dessa miRNA reducerades efter operationen
Hepatocellulärt karcinom (HCC)	En ökad mängd miR-500 hittades i sera från HCC-patienterna och dess nivåer i sera återgick till det normala efter den kirurgiska behandlingen

Se även

externa länkar