Dot blot
En dot blot (eller slot blot ) är en teknik inom molekylärbiologi som används för att detektera proteiner. Det representerar en förenkling av Western blot -metoden, med undantaget att proteinerna som ska detekteras inte först separeras genom elektrofores . Istället appliceras provet direkt på ett membran på en enda plats, och blottingproceduren utförs.
Tekniken ger betydande besparingar i tid, som kromatografi eller gelelektrofores , och de komplexa blottingprocedurerna för gelén krävs inte. Den ger dock ingen information om storleken på målproteinet.
Används
Att utföra en dot blot liknar idén att utföra en western blot, med fördelen av snabbare hastighet och lägre kostnad.
Dot blots utförs också för att screena bindningsförmågan hos en antikropp.
Metoder
Ett allmänt dot blot-protokoll innebär att man placerar 1–2 mikroliter av ett prov på ett nitrocellulosa- eller PVDF- membran och låter det lufttorka. Prover kan vara i form av vävnadskultursupernatanter, blodserum, cellextrakt eller andra preparat.
Membranet inkuberas i blockerande buffert för att förhindra ospecifik bindning. Den inkuberas sedan med en primär antikropp följt av en detektionsantikropp eller en primär antikropp konjugerad till en detektionsmolekyl (vanligen HRP eller alkaliskt fosfatas ). Efter antikroppsbindning inkuberas membranet med ett kemiluminescerande substrat och avbildas.
Anordning
Dot blot utförs konventionellt på ett stycke nitrocellulosamembran eller PVDF-membran. Efter att proteinproverna har placerats på membranet, placeras membranet i en plastbehållare och inkuberas sekventiellt i blockerande buffert, antikroppslösningar eller sköljbuffert på shaker. Slutligen, för kemiluminescensavbildning, måste membranbiten slås in i en transparent plastfilm fylld med enzymsubstrat.
Vakuumassisterad dot blot-apparat har använts för att underlätta skölj- och inkubationsprocessen genom att använda vakuum för att extrahera lösningen från undersidan av membranet, som är monterat mellan flera lager av plattor för att säkerställa god tätning mellan provbrunnarna, hålla kvar avfallslösning och leverera sugkraft. För kemiluminescenssignaldetektering måste apparaten tas isär och membranet måste tas ut och slås in i en transparent plastfilm.