Cellcykelreglerad metyltransferas

Röntgenkristallstrukturen Caulobacter crescentus CcrM som visar CcrM-homodimeren i komplex med dubbelsträngat DNA. Proteinmonomererna visas i blått och grönt medan DNA:t visas i solbränna. DNA-baserna i GANTC-igenkänningsstället visas i all atomupplösning.

CcrM (eller M.CcrMI ) är ett föräldralöst DNA-metyltransferas , som är involverat i att kontrollera genuttrycket i de flesta alfaproteobakterier . Detta enzym modifierar DNA genom att katalysera överföringen av en metylgrupp från S-adenosyl-L-metioninsubstratet till N6-positionen av en adeninbas i sekvensen 5'-GANTC-3' med hög specificitet. I vissa linjer, såsom SAR11 , har de homologa enzymerna 5'-GAWTC-3'-specificitet. I Caulobacter crescentus produceras Ccrm i slutet av replikationscykeln när Ccrm-igenkänningsställena hemimetyleras, vilket snabbt metylerar DNA:t. CcrM är väsentligt i andra Alphaproteobacteria men rollen är ännu inte fastställd. CcrM är ett mycket specifikt metyltransferas med en ny DNA-igenkänningsmekanism.

CcrM roll i cellcykelreglering

Metyleringar är epigenetisk modifiering som i eukaryoter reglerar processer som celldifferentiering och embryogenes, medan prokaryoter kan ha en roll i självigenkänning, skydda DNA från att klyvas av restriktionsendonukleassystemet eller för genreglering. Den första funktionen styrs av restriktionsmetyleringssystemet medan den andra av Orphan MTases som Dam och CcrM.

CcrM-rollen har karakteriserats i den marina modellorganismen Caulobacter crescentus , som är lämplig för studiet av cellcykel och epigenetik eftersom den asymmetriskt delar upp sig och genererar olika avkomma, en stjälkad och en svärmarecell, med olika fenotyper och genreglering. Svärmarcellen har ett enda flagellum och polär pili och kännetecknas av sin rörlighet, medan den staplade cellen har en stjälk och är fixerad till substratet. Den staplade cellen går omedelbart in i S-fas , medan svärmarcellen stannar i G1-fas och kommer att differentiera till en staplad cell innan den går in i S-fasen igen.

Den staplade cellen i S-fas kommer att replikera sitt DNA på ett semikonservativt sätt och producera två hemimetylerade DNA-dubbelsträngar som snabbt kommer att metyleras av Methyltransferase CcrM, som endast produceras i slutet av S-fasen. Enzymet kommer att metylera mer än 4 tusen 5'-GANTC-3'-ställen på cirka 20 minuter, och sedan kommer det att brytas ned av LON- proteaset . Denna snabba metylering spelar en viktig roll i transkriptionskontrollen av flera gener och styr celldifferentieringen. CcrM-uttryck regleras av CtrA-mästarregulatorn, och dessutom reglerar olika 5'-GANTC-3'-ställens metyleringsställen CcrM-uttryck, vilket endast kommer att inträffa i slutet av S-fasen när dessa platser är hemimetylerade. I denna process reglerar CtrA uttrycket av CcrM och mer än 1000 gener i det pre-divisionella tillståndet, och SciP förhindrar aktiveringen av CcrM-transkription i icke-replikativa celler.

CcrM roll i Alphaproteobacteria

Orphan MTases är vanliga i bakterier och archea. CcrM finns i nästan alla grupper av Alphaproteobacteria , förutom i Rickettsiales och Magnetococcales , och homologer kan hittas i Campylobacterota och Gammaproteobacteria . Alphaproteobacteria är organismer med olika livsstadier från fri levande till substrat associerade, några av dem är intracellulära patogener hos växter, djur och till och med människor, i dessa grupper måste CcrMs ha en viktig roll i cellcykelprogression.

CcrM missreglering har visat sig ge allvarlig misskontroll av cellcykelreglering och differentiering i olika Alphaproteobacteria; C. crescentus , växtsymbionten Sinorhizobium meliloti och hos den mänskliga patogenen Brucella abortus . Även CcrM-genen har visat sig vara väsentlig för livsdugligheten hos olika Alphaproteobacteria.

Struktur och DNA-igenkänningsmekanism

CcrM är ett typ II DNA-metyltransferas, som överför en metylgrupp från metyldonatorn SAM till N6 av en adenin i ett 5'-GANTC-3'-igenkänningsställe av hemimetylerat DNA. Baserat på ordningen av de konserverade motiven som bildar SAM-bindningen, det aktiva stället och måligenkänningsdomänen i sekvensen av CcrM kan det klassificeras som ett β-klass adenin N6 metyltransferas. CcrM-homologer i Alphaproteobacteria har en C-terminal domän med 80 rester, med icke välkarakteriserad funktion.

CcrM kännetecknas av en hög grad av sekvensdiskriminering, som visar en mycket hög specificitet för GANTC-ställen över AANTC-ställen, och kan känna igen och metylera denna sekvens i både dubbel- och enkelsträngat DNA. CcrM i komplex med en dsDNA-struktur löstes, vilket visar att enzymet presenterar en ny DNA-interaktionsmekanism, öppnar en bubbla i DNA-igenkänningsstället (den samordnade mekanismen för metyltransferaser är beroende av vändningen av målbasen), enzymet interagerar med DNA bildar en homodimer med differentiella monomerinteraktioner.

CcrM är ett mycket effektivt enzym som kan metylera ett stort antal 5'-GANTC-3'-ställen på kort tid, men om enzymet är processivt (enzymet binder till DNA och metylerar flera metyleringsställen före dissociation) eller distributivt (den enzym dissocierar från DNA efter varje metylering) är det fortfarande i diskussion. De första rapporterna indikerade det andra fallet, men nyare karakterisering av CcrM indikerar att det är ett processivt enzym.