Bakteriellt ett-hybridsystem

Figur 1: Översikt över det bakteriella enhybridsystemet . Ett bibliotek med randomiserade nukleotider som representerar potentiella transkriptionsfaktorbindningsställen (10–20 baspar), "bytet", klonas uppströms om HIS3 och URA3, positiva respektive negativa valbara markörer. Om transkriptionsfaktorn binder till den randomiserade regionen kommer den att rekrytera RNA-polymeras via direkt fusion till α- eller ω-subenheten och därmed aktivera transkription av nedströmsreportergenerna. Värd-E. coli-stammen som används måste sakna bakteriehomologerna av dessa biosyntetiska gener (HIS3 och URA3).

Det bakteriella enhybridsystemet (B1H) är en metod för att identifiera det sekvensspecifika målstället för en DNA-bindande domän . I detta system uttrycks en given transkriptionsfaktor (TF) som en fusion till en subenhet av RNA-polymeras . Parallellt klonas ett bibliotek av randomiserade oligonukleotider som representerar potentiella TF-målsekvenser in i en separat vektor innehållande de selekterbara generna HIS3 och URA3 . Om den DNA-bindande domänen (bete) binder ett potentiellt DNA-målställe (byte) in vivo , kommer det att rekrytera RNA-polymeras till promotorn och aktivera transkription av reportergenerna i den klonen. De två reportergenerna, HIS3 och URA3, möjliggör positiva respektive negativa selektioner. I slutet av processen sekvenseras positiva kloner och undersöks med verktyg för att hitta motiv för att lösa den gynnade DNA-målsekvensen.

Introduktion

Över alla levande organismer styrs reglering av genuttryck av interaktioner mellan DNA-bindande regulatoriska proteiner (transkriptionsfaktorer) och cis-regulatoriska element , DNA-sekvenser i eller runt gener som fungerar som målställen för DNA-bindande proteiner. Genom att binda till cis-regulatoriska sekvenser och till varandra finjusterar transkriptionsfaktorer transkriptionsnivåerna genom att stabilisera/destabilisera bindning av RNA-polymeras till en gens promotor. Men trots deras betydelse och överallt är lite känt om exakt var vart och ett av dessa regulatoriska proteiner binder. Litteratur tyder på att nästan 8% av mänskliga gener kodar för transkriptionsfaktorer och funktionerna och specificiteterna för deras interaktioner förblir i stort sett outforskade. Vi är på randen av en konvergens av högkapacitetsteknologier och genomteori som gör det möjligt för forskare att börja kartlägga dessa interaktioner på en genomomfattande skala. Först nyligen har en fullständig undersökning av DNA-bindande specificiteter gjorts för en stor familj av DNA-bindande domäner. B1H är bara en ny teknik bland många som är användbar för att studera protein-DNA-interaktioner.

Metodöversikt

Figur 2: Bakteriens enhybridsystem kräver två skräddarsydda plasmider: (a) "bete"-vektorn (pB1H1 eller pB1H2) som uttrycker den DNA-bindande domänen som en fusionskonstruktion med en subenhet (α eller ω) av RNA-polymeras, och (b) en reporterplasmid (pH3U3) som innehåller selekterbara markörer och ett bindningsställebibliotek, eller "byte", som potentiellt kommer att interagera med "betet".

Transformation av en bakterievärd med två olika plasmider krävs. Den ena är utformad för att uttrycka ett DNA-bindande protein av intresse som en fusionskonstruktion med en subenhet av RNA-polymeras (bete). Den andra plasmiden innehåller en region av randomiserad sekvens som representerar potentiella bindningsställen (byte) som, om den binds till av den chimära fusionsprodukten, driver expression av nedströmsreportergener. Denna reporterregion underlättar både positiv och negativ selektion av HIS3 respektive URA3, vilka tillsammans möjliggör isolering av bytet som innehåller den sanna DNA-målsekvensen. HIS3 och URA3 kodar för proteiner som krävs för biosyntes av histidin och uracil.

Att använda en negativ valbar markör är avgörande för att kraftigt minska förekomsten av falska positiva. Självaktiverande bytesdjur, där den randomiserade regionen underlättar reporteruttryck i frånvaro av TF-bindning, avlägsnas genom att omvandla reportervektorbiblioteket till bakterier i frånvaro av bete och analysera för tillväxt på plattor som innehåller 5-fluororotinsyra (5- FOA). Proteinprodukten av URA3 omvandlar 5-FOA till en giftig förening, och tillåter därigenom överlevnad för endast de kolonier som innehåller reportervektorer som inte är självaktiverande. Negativ selektion föregår normalt positivt selektion så att ett mindre, renat bytesdjursbibliotek kan utsättas för den mer rigorösa positiva selektionsprocessen. Vid transformation av det renade bytesbiblioteket med betesplasmiden uppnås positiv selektion genom att odla värden E. coli på minimalt medium som saknar histidin (NM-selektivt medium) som vanligtvis kompletteras med varierande koncentrationer av 3-amino-triazol (3-AT) ), en kompetitiv hämmare av HIS3. HIS3 kodar för ett protein som krävs för histidinbiosyntes och därför kommer endast de celler som innehåller bete-byteskombinationer som aktiverar reportergenerna att kunna växa. Manipulering av 3-AT-koncentrationer möjliggör karakterisering av bindningsstringenser. På detta sätt kan forskare bedöma hur starkt bete binder sitt byte (korrelerat med uttrycksnivån för HIS3) och därmed avgöra vilka nukleotidbindningsställen som har starka eller svaga preferenser för en given bas. Med andra ord, om celler kan växa trots en hög koncentration av 3-AT, måste bete-bytesbindning vara tillräckligt hög för att driva reportergenexpression (HIS3) på en tillräcklig nivå för att övervinna den resulterande kompetitiva hämningen. Slutligen sekvenseras och undersöks positiva kloner med redan existerande verktyg för att hitta motiv (ex, MEME, BioProspector).

Metodens historia

Bakterie-enhybridsystemet har genomgått många modifieringar sedan starten 2005. Det uppstod i slutändan som en variant av bakteriens tvåhybridsystem, skapat 2000, som i sig var inspirerat av jästens en- och tvåhybridsystem. Medan tvåhybridversionerna kan bedöma både protein-protein-interaktion och protein-DNA-interaktioner, är enhybridsystemet specialiserat på det senare. Meng et al.s B1H-system skiljer sig från tvåhybridversionen i två viktiga avseenden. Den använder ett randomiserat bytesbibliotek bestående av många (<2x10 ⁸ ) unika potentiella målsekvenser och lägger också till ett negativt urvalssteg för att rensa detta bibliotek från självaktiverande kloner. Även om dessa idéer lånades från det ursprungliga enhybridsystemet från jäst, hade de ännu inte applicerats på en bakterievärd före 2005. När tekniken växte i popularitet ändrade forskare sina protokoll för att förbättra B1H-systemet. Design av fusionskonstruktionen (bete) till omega, snarare än alfa, subenheten av RNA-polymeras har nyligen gynnats för att förbättra chimärens stereokemi och dynamiska omfång. En zink-finger- domän på fusionskonstruktionen och dess motsvarande DNA-målställe, intill den randomiserade bytessekvensen, har också lagts till för att öka affiniteten och specificiteten hos protein-DNA-interaktioner. Denna ökade totala bindningsaffinitet möjliggör karakterisering av även de DNA-bindande domänproteiner som interagerar svagt med en målsekvens.

Figur 3: Översikt över B1H negativa och positiva urvalsprocedurer. DNA-segmentet märkt 'RR' hänvisar till den randomiserade regionen på bytesvektorer. Självaktiverande sekvenser renas bort från det ursprungliga bindningsställesbiblioteket genom att försöka odla bytestransformerade E. coli på medium innehållande 5-FOA, en förening som klyvs till ett toxin av URA3. Det resulterande renade bytesbiblioteket transformeras sedan med betesplasmiden och odlas på minimalt medium som saknar histidin för att positivt selektera för aktivt uttryckta reportervektorer. Detta medium kompletteras med varierande koncentrationer av 3-AT, en kompetitiv hämmare av HIS3, för att belysa bindningsaffiniteterna för transkriptionsfaktorn till varje särskild målsekvens. De randomiserade regionerna från överlevande kolonier isoleras sedan och sekvenseras före motivfinnande analys (ex, MEME, BioProspector). Slutligen genereras optimala och tolererade baser vid nyckelbindningsställepositionerna

.

Fördelar

B1H-systemet har betydande fördelar jämfört med andra metoder som undersöker protein-DNA-interaktioner. Mikroarray -baserad avläsning av kromatinimmunfällning ( ChIP-chip ) för bestämning av bindningsställe med hög genomströmning bygger på specifika antikroppar som kanske inte alltid är tillgängliga. Metoder som förlitar sig på proteinbindande mikroarrayer kräver också ytterligare proteinreningssteg som inte krävs i B1H-systemet. Dessutom är dessa mikroarray-baserade tekniker ofta oöverkomliga när det gäller att kräva speciella faciliteter och expertis för att analysera de resulterande data. SELEX , ett annat system som vanligtvis används för att identifiera målnukleinsyrorna för DNA-bindande proteiner, kräver flera selektionsomgångar. Däremot kräver det bakteriella enhybridsystemet bara en omgång av in vitro-val och erbjuder också ett lågteknologiskt alternativ till mikroarraybaserade teknologier. Antikroppar krävs inte för att studera interaktioner mellan DNA-bindande proteiner i B1H-systemet. En ytterligare fördel är att B1H-systemet fungerar inte bara för monomera proteiner utan även för proteiner som binder DNA som komplex. B1H-systemet bör betraktas som en specialiserad teknik för att studera DNA-proteininteraktioner, medan tvåhybridvariationerna (B2H och Y2H ) kan bedöma både protein-protein- och protein-DNA-interaktioner. Dessa tvåhybridsystem är multifunktionella men är begränsade när det gäller att analysera endast ett enda "byte"-bibliotek. En fördel med det bakteriella enhybridsystemet jämfört med jäst-enhybridsystemet (Y1H) ligger i den högre omvandlingseffektiviteten av plasmider till bakterier som gör det möjligt att undersöka mer komplexa "bytesdjur"-bibliotek.

Begränsningar

Trots dess ovan nämnda fördelar som ett specialiserat verktyg har B1H-systemet vissa nackdelar. För det första är B1H-selektionssystemet begränsad i sin förmåga att bestämma bindningsspecificiteterna för transkriptionsfaktorer med långa bindningsställen. Detta beror på det faktum att antalet randomiserade "byte"-kloner som krävs för att representera alla möjliga målsekvenser ökar exponentiellt med antalet nukleotider i den målsekvensen. För det andra kanske vissa eukaryota faktorer inte uttrycks eller vikas effektivt i bakteriesystemet, vilket tillskrivs olika regulatoriska nätverk och transkriptionsmaskineri. Därför kan ett jästbaserat hybridsystem vara fördelaktigt när man arbetar med DNA-bindande proteiner av eukaryot ursprung. För det tredje kanske B1H-systemet inte är idealiskt lämpat för transkriptionsfaktorer som känner igen bindningsställen med låg affinitet. Logiken här är att konkurrens skapad av bindningsställen någon annanstans i bakteriegenomet kan begränsa signalen som kan realiseras från ett enda bindningsställe som finns uppströms om reportern.

Ansökan

B1H-systemet tillhandahåller ett verktyg i vår arsenal för att identifiera de DNA-bindande specificiteterna för transkriptionsfaktorer och därmed förutsäga deras målgener och genomiska DNA-reglerande element. Det möjliggör också undersökning av effekterna av protein-protein-interaktioner på DNA-bindning, vilket ytterligare kan styra förutsägelsen av cis-regulatoriska moduler baserade på bindningsplatsklustring. Dessutom har B1H-selektionssystemet implikationer för de förutsägande reglerande rollerna för tidigare okarakteriserade transkriptionsfaktorer.

Specifika exempel

Genom att använda det bakteriella enhybridsystemet har en studie karakteriserat 35 medlemmar av Drosophila melanogaster-segmenteringsnätverket som inkluderar representativa medlemmar av alla huvudklasserna av DNA-bindande domänproteiner. Implikationer för medicinsk forskning är uppenbara från en annan studie som använde B1H-systemet för att identifiera DNA-bindningsspecificiteten hos en transkriptionell regulator för en gen i Mycobacterium tuberculosis . B1H-systemet har också använts för att identifiera ett viktigt omsättningselement i Escherichia coli.

externa länkar