Asymmetrisk flödesfältflödesfraktionering
Asymmetrisk flödesfältflödesfraktionering (AF4) är den mest mångsidiga och mest använda subtekniken inom familjen fältflödesfraktioneringsmetoder ( FFF). AF4 kan användas i vattenhaltiga och organiska lösningsmedel och kan karakterisera nanopartiklar, polymerer och proteiner. Teorin för AF4 skapades 1986 och etablerades 1987 och publicerades först av Wahlund och Giddings. AF4 skiljer sig från symmetriskt flöde FFF eftersom det endast innehåller en permeabel vägg så att tvärflödet endast orsakas av bärarvätskan. Tvärflödet induceras av att bärarvätskan ständigt kommer ut via den semipermeabla väggen på kanalens botten.
Tillämpningar och detektionsmetoder
Asymmetrisk flödesfältflödesfraktionering (AF4) är numera en vanlig och toppmodern metod för fraktionering och separation av makromolekyler och partiklar i en suspension. AF4 är ett alternativ till HPLC och SEC i de fall kolonnkromatografi inte är lämplig för analyten. HPLC eller SEC skulle användas för vätskeseparationer för molekyler upp till 1000 kDa och nanopartiklar upp till 10 nm. När storleken ökar över 10 nm blir AF4 överlägsen vad gäller upplösning och återhämtning.
AF4:s applikationer är flexibla för många analytiska förhållanden där en kolonnbaserad metod inte skulle kunna separera de önskade partiklarna ordentligt. För makromolekyler och nanopartiklar är AF4 en alternativ metod, särskilt när den stationära fasen i kolumner interagerar med provet. AF4 är speciellt kraftfull för inhomogena prover där den kan separera lösliga makromolekyler från partiklar eller aggregat.
AF4 och andra FFF-metoder har i stor utsträckning använts i miljöforskning om inverkan av nanomaterial och för att karakterisera kondenserade tannineroxidation .
För polymerer med hög molmassa och grenade polymerer har AF4 visat sig uppnå god separation, medan SEC misslyckas och AF4 har applicerats på polyolefiner vid temperaturer över 150 C.
Detektionsmetoderna är desamma som för FFF i allmänhet, UV är mest populärt som koncentrationsdetektor, men de flesta AF4-system inkluderar en flervinklar ljusspridningsdetektor för direkt mätning eller storlek och molmassa.
Operativa rutiner
AF4-experimentet kan delas upp i tre steg:
1. Provinjektion
- Prover injiceras i systemet med användning av en känd mängd provvolym. Denna volym kommer att bero på AF4-instrumentet som används i experimentet. Att starta fraktionering omedelbart efter provinjektion är inte idealiskt eftersom provet kommer att spridas ut slumpmässigt från injektionsstället, så starthastigheten och partiklarnas plats är inte desamma. Detta leder till linjebreddning och insufficiens. För att rätta till ett sådant fel föreslås provfokusering.
2. Provfokusering
- En ström som går mitt emot bärarlösningsmedlet används för att fokusera alla partiklar i provet till ett specificerat område innan fraktionering påbörjas. Detta korrigerar för eventuell toppbreddning som kan uppstå på grund av att partiklar sprids från injektionsporten till kanalutloppet innan fraktionering påbörjas. Provberedning är ett annat alternativ som kan uppnås i fokussteget. När alla partiklar är i samma område av kanalen kan fraktionering ske.
3. Fraktionering
- Det finns två komponenter som utgör FFF-systemet. För det första det laminära flödet som för provet genom separationskammaren och för det andra det separationsfält som appliceras vinkelrätt mot kanalen, mot provflödet.
- När partiklar strömmar längs kanalen trycker tvärflödesseparationsfältet molekylerna mot botten av kanalen. När de passerar botten genomgår de en motverkande diffusion tillbaka in i kanalen mot bärarflödet. I vilken utsträckning molekylerna kan diffundera tillbaka in i kanalen dikteras av deras naturliga Brownska rörelse, en egenskap baserad på storlek som är unik för varje enskild art. Mindre partiklar har en högre Brownsk rörelse än större och kan diffundera högre in i kanalen mot bärarflödet.
- Hastigheten för laminärt flöde i kanalen är inte enhetlig. Den färdas i ett paraboliskt mönster med flödeshastigheten som ökar mot mitten av kanalen och minskar mot sidorna. Därför kommer hastigheten med vilken partiklar kommer att föras igenom att bero på deras position i kanalen. De med en större diffusion, som ligger i mitten av kanalen, kommer att transporteras med en högre hastighet. De större partiklarna i den grunda, långsammare strömmen transporteras med lägre flödeshastighet och eluerar senare än mindre partiklar. Detta resulterar i en försiktig separation av partiklar baserat på massa med elueringsordningen från minsta till största.