Annexin A5 affinitetsanalys

Inom molekylärbiologi är en annexin A5-affinitetsanalys ett test för att kvantifiera antalet celler som genomgår apoptos . Analysen använder proteinannexin A5 för att märka apoptotiska och döda celler, och siffrorna räknas sedan med antingen flödescytometri eller ett fluorescensmikroskop .

Annexin a5-proteinet binder till apoptotiska celler på ett kalciumberoende sätt med hjälp av fosfatidylserin -innehållande membranytor som vanligtvis endast finns på membranets inre broschyr.

Bakgrund

Apoptos är en form av programmerad celldöd som används av kroppen för att avlägsna oönskade, skadade eller åldrande celler från vävnader. Avlägsnande av apoptotiska celler utförs via fagocytos av vita blodkroppar såsom makrofager och dendritiska celler. Fagocytiska vita blodkroppar känner igen apoptotiska celler genom att de utsätts för negativt laddade fosfolipider (fosfatidylserin) på cellytan.

I normala celler finns de negativa fosfolipiderna på insidan av cellmembranet medan den yttre ytan av membranet är upptagen av oladdade fosfolipider. Efter att en cell har gått in i apoptos, transporteras de negativt laddade fosfolipiderna till den yttre cellytan av ett hypotetiskt protein som kallas scramblase . Fagocytiska vita blodkroppar uttrycker en receptor som kan binda till och detektera de negativt laddade fosfolipiderna på de apoptotiska cellytorna. Efter detektion avlägsnas de apoptotiska cellerna.

Detektering av celldöd med annexin A5

Friska individuella apoptotiska celler avlägsnas snabbt av fagocyter. I patologiska processer kan emellertid avlägsnandet av apoptotiska celler vara försenat eller till och med frånvarande. Döende celler i vävnad kan detekteras med annexin A5. Märkning av annexin A5 med fluorescerande eller radioaktiva molekyler gör det möjligt att detektera bindning av märkt annexin A5 till cellytan av apoptotiska celler. Efter bindning till fosfolipidytan samlas annexin A5 till ett trimeriskt kluster. Denna trimer består av tre annexin A5-molekyler som är bundna till varandra via icke-kovalenta protein-protein-interaktioner. Bildandet av annexin A5-trimerer resulterar i bildandet av ett tvådimensionellt kristallgitter på fosfolipidmembranet. Denna klustring av annexin A5 på membranet ökar kraftigt intensiteten av annexin A5 när det märks med en fluorescerande eller radioaktiv sond. Tvådimensionell kristallbildning tros orsaka internalisering av annexin A5 genom en ny process av endocytos om den inträffar på celler som befinner sig i den tidiga fasen av exekvering av celldöd. Internalisering förstärker dessutom intensiteten hos den annexin A5-färgade cellen.

Annexin A5 har använts för att successivt detektera apoptotiska celler in vitro och in vivo . Patologiska processer där apoptos inträffar inkluderar inflammation, ischemiskada i hjärtat orsakad av hjärtinfarkt, apoptotiska vita blodkroppar och glatta muskelceller som finns i aterosklerotiska plack av blodkärl, transplanterade organ i donatorpatienten som stöts bort av immunsystemet eller tumören. celler som utsätts för cytostatika under kemoterapi.

Den icke-invasiva upptäckten av sjuk vävnad med till exempel radioaktivt märkt annexin A5 är målet för en nyligen utvecklad forskningslinje som kallas Molecular Imaging.

Molekylär avbildning av celldöd med hjälp av radioaktivt annexin A5 kan bli av klinisk betydelse för att diagnostisera sårbarhet av aterosklerotiska plack (instabil ateroskleros ), hjärtsvikt , transplantatavstötning och för att övervaka effektiviteten av anticancerterapi .