Affinitetsetikett

Affinitetsmärkningar är en klass av enzyminhibitorer som kovalent binder till sitt mål och orsakar dess inaktivering. Kännetecknet för en affinitetsmärkning är användningen av en målgrupp för att specifikt och reversibelt leverera en svagt reaktiv grupp till enzymet som irreversibelt binder till en aminosyrarest. Den målsökande delen av märkningen liknar ofta enzymets naturliga substrat så att ett liknande sätt för icke-kovalent bindning används före den kovalenta kopplingen. Deras användbarhet inom medicin kan begränsas av specificiteten hos det första icke-kovalenta bindningssteget, medan urskillningslös verkan kan användas för ändamål såsom affinitetsmärkning - en teknik för validering av substratspecifik bindning av föreningar.

Dessa märkningar är inte begränsade till enzymer utan kan också utformas för att reagera med antikroppar eller ribozymer även om denna användning är mindre vanlig. Även om proteiner såsom hemoglobin inte har ett aktivt ställe, kan bindningsfickor utnyttjas för sin affinitet och därmed märkas.

Klassificeringar

Affinitetsetiketter kan delas upp i tre distinkta kategorier baserat på deras reaktiva grupper och leveranssätt.

Klassiska affinitetsetiketter

Denna kategori omfattar det enklaste tillvägagångssättet att koppla en elektrofil med låg inneboende reaktivitet till en icke-kovalent bindande del som ofta efterliknar det naturliga substratet. Nyckeln till denna beteckning är att elektrofilens reaktivitet inte förändras av enzymet och att den icke-kovalenta bindningsdelen tjänar till att öka närvaron och livslängden för elektrofilen i det aktiva stället ( effektiv molaritet ). Den svagt reaktiva gruppen kan reagera med funktionella grupper utanför det aktiva stället eller på andra proteiner, men selektiviteten förlänas av den icke-kovalenta bindningsdelen. Kinetiska signaturer av denna typ av inhibitor kan hittas i mättnad på grund av att den kovalenta reaktionen (kinact) blir det hastighetsbegränsande steget vid höga koncentrationer av inhibitor. En handfull läkemedel som afatinib har fått FDA-godkännande genom detta tillvägagångssätt. Det omvända tillvägagångssättet att använda en svagt nukleofil hämmare för att attackera en proteinbunden elektrofil har också studerats. Detta tillvägagångssätt har fått mycket mindre uppmärksamhet på grund av bristen på proteinelektrofiler och endast de med lämpliga kofaktorer kan riktas mot.

Stilla affinitetsetiketter

Stilla affinitetsmärkningar representerar ett lovande tillvägagångssätt för att hämma enzymer genom att använda "maskerade" reaktiva funktionaliteter som bara avslöjas inom det aktiva stället. Detta tillvägagångssätt skiljer sig från mekanismbaserade inaktiverare genom att katalysen måste vara "off-pathway". Ett av de bästa exemplen för att förklara denna form av katalys är inaktiveringen av dimetylargin-dimetylaminohydrolas (DDAH) av 4-halopyridiner. Vid fysiologiskt pH har 4-halogruppen nästan försumbar reaktivitet med tiolater men vid protonering av kvävet ökar reaktiviteten ~4500 gånger. Denna protonering sker utanför vägen av en aspartatrest som normalt inte är involverad i katalys. Efter attack av cystein på det aktiva stället och förlust av halogeniden modifieras enzymet irreversibelt. Detta krav på katalys ställer in modifieringsselektiviteten. Denna klass är inte begränsad till halopyridiner och funktionella grupper inklusive epoxider och peptidylacyloximetylketoner har använts. Den kinetiska signaturen för denna klass liknar den för klassiska affinitetsetiketter. Denna term har tidigare använts för att beskriva affinitetsmärkningar som innehåller svagt reaktiva grupper men nyare litteratur har börjat om kravet på off-pathway-katalys.

Fotoaffinitetsetiketter

Fotoaffinitetsmärkningar kännetecknas av icke-enzymatisk reaktivitet producerad genom exponering för ljus och en icke-kovalent målgrupp för att öka den effektiva molariteten hos denna reaktiva grupp i det aktiva stället. Även om denna teknik verkar bra i teorin, observeras ofta låg grad av märkning, främst på grund av att de reaktiva ämnena släcks av lösningsmedel eller andra ämnen i lösning. Emellertid kan denna släckning vara fördelaktig eftersom det är en så snabb process att när den reaktiva substansen väl har bildats, kommer den inte att diffundera i någon nämnvärd omfattning och kommer endast att reagera med molekyler till vilka den ligger omedelbart intill.

Fotoaffinitetsmärkningar visar inte något stort lovande för hämning eller vid användning av läkemedel men är lämpligt lämpade för att identifiera ligandbindningsställen. Reaktiva grupper såsom nitrener eller 2-aryl-5-karboxytetrazoler används ofta för att generera höggradigt reaktiva, icke-selektiva karbener respektive måttligt selektiva nitril-iminintermediärer.

Användning av affinitetsmärkning

När man karakteriserar ett enzym är det viktigt att identifiera de aminosyrarester som är ansvariga för katalys. Även om det är tydligt att röntgenkristallografi kommer att ge mer detaljerad 3D-information om den aktiva platsen, returneras endast en statisk bild och svårigheter kan uppstå med samkristallisering av substratet eller härmar på grund av enzymatisk omsättning.

Det klassiska exemplet på användningen av affinitetsmärkningar för detta ändamål är att kartlägga topografin för det aktiva stället för kymotrypsin. Genom användningen av tre olika affinitetsmärkningar som placerade reaktiva grupper (halometylketoner eller fosfofluorider) på olika regioner av den naturliga substratkärnan, kunde de relativa positionerna och identiteten för tre olika aminosyror bestämmas. Ett annat anmärkningsvärt exempel på användning av affinitetsmärkning för att bestämma det aktiva stället för ett enzym är det arbete som utförts av Grachev et al. vilket resulterade i karakterisering av β-subenheten av kärn-RNA-polymeraset som subenheten ansvarig för fosfodiester-bindningsbildning i processen för prokaryotisk transkription.

Aktivitetsbaserad proteinprofilering (ABPP)

Den grundläggande enheten för aktivitetsbaserad proteomik är sonden, som vanligtvis består av två element: en reaktiv grupp (RG, ibland kallad "stridsspets") och en tagg. Dessutom kan vissa prober innehålla en bindande grupp som ökar selektiviteten. Den reaktiva gruppen innehåller vanligtvis en speciellt utformad elektrofil som blir kovalent kopplad till en nukleofil rest i det aktiva stället för ett aktivt enzym. Ett enzym som är hämmat eller post-translationellt modifierat kommer inte att reagera med en aktivitetsbaserad sond. Taggen kan vara antingen en reporter såsom en fluorofor eller en affinitetsmärkning såsom biotin eller en alkyn eller azid för användning med Huisgen 1,3-dipolär cykloaddition (även känd som klickkemi).

Se även

• Självmordshämning