ABI Solid Sequencing

Huvudartikel: 2-baskodning
Biblioteksförberedelser för SOLiD-plattformen
Tvåbaskodningsschema. Vid tvåbaskodning tilldelas varje unikt par av baser på 3'-änden av sonden en av fyra möjliga färger. Till exempel, "AA" tilldelas blått, "AC" tilldelas grönt och så vidare för alla 16 unika par. Under sekvensering sekvenseras varje bas i mallen två gånger, och den resulterande datan avkodas enligt detta schema.

SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) är en nästa generations DNA-sekvenseringsteknologi utvecklad av Life Technologies och har varit kommersiellt tillgänglig sedan 2006. Denna nästa generations teknologi genererar 10 8 - 10 9 små sekvensavläsningar på en gång. Den använder 2 baskodning för att avkoda rådata som genereras av sekvenseringsplattformen till sekvensdata.

Denna metod ska inte förväxlas med "sekvensering genom syntes", en princip som används av Roche-454 pyrosequencing (introducerades 2005, genererade miljontals 200-400bp läsningar 2009), och Solexa -systemet (nu ägs av Illumina) (introducerat i 2006, genererade hundratals miljoner 50-100bp läsningar 2009)

Dessa metoder har reducerat kostnaden från 0,01 USD/bas 2004 till nästan 0,0001 USD/bas 2006 och ökat sekvenseringskapaciteten från 1 000 000 baser/maskin/dag 2004 till mer än 5 000 000 000 baser/maskin/dag i publikationer över 2000 09-publikationer. dess användning först för nukleosompositionering från Valouev et al., transkriptionsprofilering eller strängkänslig RNA-Seq med Cloonan et al., transkriptionell profilering av enkelceller med Tang et al. och slutligen mänsklig återsekvensering med McKernan et al.

Metoden som används av den här maskinen (sekvensering-för-ligering) har rapporterats ha vissa problem med sekvensering av palindromiska sekvenser.

Kemi

Ett bibliotek av DNA-fragment framställs från provet som ska sekvenseras och används för att framställa klonala pärlpopulationer. Det vill säga, endast en art av fragment kommer att finnas på ytan av varje magnetisk pärla. Fragmenten fästa vid de magnetiska pärlorna kommer att ha en universell P1-adaptersekvens fäst så att startsekvensen för varje fragment är både känd och identisk. Emulsions- PCR sker i mikroreaktorer som innehåller alla nödvändiga reagenser för PCR. Pärlorna med de resulterande PCR-produkterna deponeras på ett objektglas.

Primers hybridiserar till P1-adaptersekvensen i biblioteksmallen. En uppsättning av fyra fluorescensmärkta di-bassonder tävlar om ligering till sekvenseringsprimern. Specificiteten för di-bassonden uppnås genom att förhöra var 1:a och 2:a bas i varje ligeringsreaktion. Flera cykler av ligering, detektion och klyvning utförs med antalet cykler som bestämmer den slutliga avläsningslängden. Efter en serie ligeringscykler avlägsnas förlängningsprodukten och mallen återställs med en primer som är komplementär till n-1-positionen för en andra omgång av ligeringscykler.

Fem omgångar av primeråterställning genomförs för varje sekvenstagg. Genom primeråterställningsprocessen förfrågas varje bas i två oberoende ligeringsreaktioner av två olika primrar. Till exempel analyseras basen vid avläst position 5 med primer nummer 2 i ligeringscykel 2 och med primer nummer 3 i ligeringscykel 1.

Genomströmning & noggrannhet

Enligt ABI ger SOLiD 3plus-plattformen 60 gigabaser användbar DNA-data per körning. Tack vare kodningssystemet med två baser är en inneboende noggrannhetskontroll inbyggd i tekniken och ger 99,94 % noggrannhet. Systemens kemi innebär också att det inte hindras av homopolymerer till skillnad från Roche 454 FLX-systemet och så stora och svåra homopolymerupprepningsregioner är inte längre ett problem att sekvensera.

Ansökningar

Naturligtvis kommer tekniken att användas för att sekvensera DNA, men på grund av den höga parallella naturen hos alla nästa generations teknologier har de även tillämpningar inom transkriptomik och epigenomik .

Microarrays var en gång stöttepelaren i transkriptomiken de senaste tio åren och array-baserad teknologi har därefter förgrenats till andra områden. De är dock begränsade genom att endast information kan erhållas för sonder som finns på chipet. Endast information för organismer för vilka det finns chips kan erhållas, och de kommer med alla problem med att hybridisera ett stort antal molekyler (olika hybridiseringstemperaturer). RNA-Seq transcriptomics genom nästa gen sekvensering kommer att innebära att dessa barriärer inte längre gäller. Varje organisms hela transkriptom skulle potentiellt kunna sekvenseras i en körning (för mycket små bakteriegenom) och inte bara skulle identifieringen av varje transkript vara tillgänglig utan uttrycksprofilering är möjlig eftersom kvantitativa avläsningar också kan uppnås.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) är en metod för att bestämma transkriptionsfaktorbindningsställen och DNA-proteininteraktioner. Det har tidigare kombinerats med array-teknik (ChIP-chip) med viss framgång. Nästa generations sekvensering kan också användas i detta område. Metyleringsimmunfällning (MeDIP) kan också utföras och även på arrayer.

Förmågan att lära oss mer om metylering och TF-bindningsställen i en genomskala är en värdefull resurs och kan lära oss mycket om sjukdomar och molekylärbiologi i allmänhet.

Se även

Vidare läsning

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=ABI_Solid_Sequencing&oldid=1123467466 "